【摘要】：蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thurigiensis,Bt)是一種革蘭氏陽性菌,廣泛地存在于自然界中。Bt最大的特點(diǎn)是可以在形成芽胞的同時(shí)形成伴胞晶體,伴胞晶體進(jìn)入昆蟲體內(nèi)后會(huì)在一系列的作用下形成具有殺蟲活性的殺蟲晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs),對昆蟲產(chǎn)生毒殺作用。鱗翅目昆蟲(Lepidoptera)作為我國農(nóng)業(yè)害蟲之一,屬于Bt的靶標(biāo)昆蟲,其幼蟲中腸呈微氧且偏堿的pH環(huán)境。堿性環(huán)境有利于伴胞晶體發(fā)揮毒性,但對于Bt來說卻是一種環(huán)境脅迫,因此,研究Bt的堿耐受性十分重要。實(shí)驗(yàn)室前期通過堿刺激芯片等技術(shù)手段研究發(fā)現(xiàn)L-乳酸在Bt的堿耐受性中起到關(guān)鍵作用。本研究在此基礎(chǔ)上,以亞洲玉米螟(ACB-BtS)為供試?yán)ハx對Bt L-乳酸代謝途徑中相關(guān)基因的缺失突變株進(jìn)行生物活性檢測,發(fā)現(xiàn)缺失L-乳酸透性酶基因lpm及轉(zhuǎn)錄因子crp基因后,Bt的毒力均會(huì)受到影響,進(jìn)一步證明L-乳酸代謝對于Bt的重要性以及轉(zhuǎn)錄因子Crp在Bt殺蟲活性中的重要作用。其中,轉(zhuǎn)錄因子Crp編碼的CRP蛋白又稱cAMP受體蛋白,其在大腸桿菌中調(diào)控近200個(gè)功能基因,而在Bt中未見相關(guān)的報(bào)道,為了探索Bt中轉(zhuǎn)錄因子Crp在堿性條件下調(diào)控的功能基因網(wǎng)絡(luò),本研究提取了Bt HD73和HD(Δcrp)菌株在28 mM堿處理下的總RNA,利用高通量測序手段對其進(jìn)行RNA-seq分析。發(fā)現(xiàn)在28 mM堿處理?xiàng)l件下,Bt中受crp調(diào)控的基因約有1382個(gè),受其正調(diào)控的有528個(gè),負(fù)調(diào)控的有754個(gè),這些功能基因主要富集在碳代謝、氨基酸代謝、能量代謝和氮代謝等途徑中。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示,在谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)代謝途徑中的谷氨酰胺合成酶基因glnA(Gene ID:HD73_3986)和谷氨酰胺合成酶抑制子基因glnR(Gene ID:HD73_3987)均受轉(zhuǎn)錄因子Crp調(diào)控。谷氨酰胺合成酶廣泛存在于生物體中,參與眾多代謝途徑中,為了研究Bt中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及對Bt殺蟲毒力的影響,本研究構(gòu)建了glnRA操縱子的啟動(dòng)子融合lacZ基因的表達(dá)載體,測定HD73和HD(Δcrp)菌株中PglnRA的轉(zhuǎn)錄活性。同時(shí),本研究構(gòu)建了谷氨酰胺合成酶抑制子基因glnR(Gene ID:HD73_3987)的缺失突變株及谷氨酰胺合成酶過表達(dá)菌株,分析谷氨酰胺合成酶的轉(zhuǎn)路及過表達(dá)。本研究主要結(jié)果闡述如下:1.Bt芽胞可以提高Cry蛋白的殺蟲活性本研究通過對不同濃度Bt芽胞及相對濃度的Cry1AC晶體蛋白混合物的殺蟲活性進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)在亞致死濃度的Cry1AC蛋白飼喂條件下,加入一定濃度的Bt芽胞可以有效增加其對亞洲玉米螟的殺蟲活性。此方法可以更直觀地確定相關(guān)基因?qū)t殺蟲活性的影響。2.L-乳酸代謝參與到Bt的堿適應(yīng)性本研究通過構(gòu)建L-乳酸透性酶基因的缺失突變株HD(Δlpm),使用上述的生測方法,測定L-乳酸代謝相關(guān)基因缺失突變株HD(Δcrp)和HD(Δlpm)的殺蟲活性,發(fā)現(xiàn)缺失這些基因后Bt的殺蟲活性會(huì)顯著降低,同時(shí)測定其堿刺激下基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,從而明確L-乳酸代謝參與到Bt的堿適應(yīng)性中。3.明確谷氨酰胺合成酶代謝對Bt殺蟲活性的影響結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄因子Crp會(huì)正調(diào)控谷氨酰胺合成酶代謝途徑中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。為了驗(yàn)證這一結(jié)論,本研究測定谷氨酰胺合成酶操縱子glnRA的轉(zhuǎn)錄活性,結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。為了明確谷氨酰胺代謝在Bt殺蟲活性中起到的作用,本研究從轉(zhuǎn)錄和過表達(dá)兩個(gè)方面對其進(jìn)行研究,構(gòu)建谷氨酰胺合成酶抑制子基因glnR的缺失突變體及谷氨酰胺合成酶基因glnA的過表達(dá)菌株。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在營養(yǎng)豐富時(shí),glnR會(huì)負(fù)調(diào)控操縱子glnRA的轉(zhuǎn)錄。同時(shí),過表達(dá)谷氨酰胺合成酶后,Bt的殺蟲活性得到了顯著的提高。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S476

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