【摘要】：水稻條紋病毒(Rice stripetenuivirus,RSV)是白細病毒科(Phenuiviridae),纖細病毒屬(Tenuivirus)代表成員,其基因組含4條單鏈RNA,通過負(fù)義或雙義策略共編碼7個蛋白。與其它分段負(fù)義RNA病毒(sNSV)一樣,RSV在基因表達過程中采用“抓帽”機制,即從寄主mRNA抓取一段10-20個堿基的帽子序列,以之作為引物起始轉(zhuǎn)錄,合成5'端含一段異源序列的病毒mRNA。最近,本實驗室利用高通量測序技術(shù)獲得了 RSVNP和NCPmRNA的帽子序列,為解析RSV的“抓帽”機制提供了許多新的視角。然而,由于RSV其它mRNA相對于基因組RNA(或其互補鏈)的含量太低,在經(jīng)過多次嘗試后,我們無法獲得它們的帽子序列,因而我們不能確定所得數(shù)據(jù)是否具有偏頗。尤其,我們發(fā)現(xiàn)RSV在合成NP和NCP mRNA時,使用“引發(fā)與重配”(prime-and-realign)機制的頻率不同,但不確定RSV合成其它mRNA時是否也存在這種差異。查閱文獻發(fā)現(xiàn),eIF4E蛋白能結(jié)合mRNA的帽子結(jié)構(gòu)。已有研究者通過基因改造,提高了 eIF4E對帽子結(jié)構(gòu)的親和性。也已有研究者利用eIF4E蛋白突變體(eIF4EK119A)富集含帽子結(jié)構(gòu)的RNA�；诖�,本研究嘗試?yán)胑IF4EK119A富集RSV mRNA,進而獲得更完整的RSV帽子序列譜。首先,本研究將eIF4EK119A構(gòu)建到帶GST標(biāo)簽的原核表達載體pGEX-4T-3,所得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)Rosseta菌株;通過優(yōu)化條件(IPTG終濃度為0.25 mMol,16 ℃、180rpm、10-13 h)獲得 eIF4EK119A 蛋白;將 eIF4EK1 19A 蛋白(GST磁珠結(jié)合)與提取自RSV侵染水稻的60μg總RNA混合,以免疫共沉淀的方式獲得富集的mRNA 3 μg;以富集的mRNA為底物,利用本實驗室已建立的技術(shù),先對 RSVNVS2、NSvc2、NS3、NCP 和 NSvc46 種 mRNA 的 5'端進行了傳統(tǒng)的克隆和測序。結(jié)果表明,所得序列90%含帽子序列,這表明本研究成功以 eIF4EK119A 富集了 RSV mRNA。本研究接著以富集的RSV mRNA為材料,利用Cap-seq技術(shù),獲取了NS2、NSvc2、NS3、NP、NCP和 NSvc4 6 種 mRNA 的“帽子序列譜”,分析結(jié)果表明:(1)在合成各mRNA時,RSV的“抓帽”模式無明顯差異;(2)RSV在轉(zhuǎn)錄病毒鏈時比轉(zhuǎn)錄互補鏈時更頻繁地使用“引發(fā)與重配”機制,其結(jié)果是RSV病毒鏈的轉(zhuǎn)錄物比互補鏈的轉(zhuǎn)錄物具有更長和更復(fù)雜的帽子序列。本研究利用eIF4EK119A蛋白實現(xiàn)了 RSVmRNA的富集,并在此基礎(chǔ)上,首次獲得了一個較為完整的RSV“帽子序列譜”。以此為基礎(chǔ),本研究首次表明RSV在轉(zhuǎn)錄病毒鏈時比轉(zhuǎn)錄互補鏈時更頻繁地使用“引發(fā)與重配”機制,這為進一步認(rèn)識RSV的“抓帽”機理邁出了重要一步。
【圖文】：

結(jié)構(gòu)；而多分體負(fù)義ＲＮＡ病毒普遍采用的一種策略是，從寄主那里奪取一段含逡逑帽子結(jié)構(gòu)的ＲＮＡ序列，來作為引物起始自身ｍＲＮＡ的轉(zhuǎn)錄（Ｄｅｃｒｏｌｙｅ／ａ／．，逡逑２０１２），生成５＇端含有一段“異源”帽子序列（來源于寄主，如圖１邋－邋１邋）的病逡逑毒ｍＲＮＡ邋（ＤｅｃｒｏｌｙｅＭ／．，，２０１１），該過程被稱為“抓帽”機制。逡逑５，邐？丨丨＿丨｜＇逡逑丨邋丨邐邐｜逡逑ｙ邐ｙ逡逑異源帽子序列邐病毒序列逡逑圖卜１邋“抓帽”病毒的ｍＲＮＡ結(jié)構(gòu)。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｍＲＮＡ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ａ邋“ｃａｐ－ｓｎａｔｃｈｉｎｇ”邋ｖｉｒｕｓ邋．逡逑１．１．１邐“抓帽”機制在流感病毒上的發(fā)現(xiàn)逡逑“抓帽”最早發(fā)現(xiàn)于感病毒。早在上世紀(jì)７０年代中后期，研究者就發(fā)現(xiàn)逡逑了一些相關(guān)的證據(jù)，并最終揭示了這一現(xiàn)象：（１）寄主的聚合酶ＩＩ邋（Ｐｏ丨ＩＩ）逡逑活性影響流感病毒的侵染和增殖（Ｓｐｏｏｎｅｒ邋ａｎｄ邋Ｒｉｃｈａｒｄ，邋１９７７）邋；邐（２）雖然體內(nèi)逡逑合成的流感病毒ｍＲＮＡ含有帽子結(jié)構(gòu)，提純的流感病毒粒子卻無加帽活性逡逑（Ｋｒｕｇｅ／？／．，邋１９７６；邋Ｐｌｏｔｃｌｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋１９７８）邋；邐（３）在體外轉(zhuǎn)錄體系中，加入含帽子逡逑結(jié)構(gòu)的ｍＲＮＡ能顯著提高流感病毒的轉(zhuǎn)錄活性（Ｂｏｕｌｏｙｅ／？／．

型方式傳播并且可經(jīng)卵垂直傳播給下一代，被感染的水稻植株葉片早期出現(xiàn)與葉逡逑脈平行的淺綠色條紋斑，隨著病毒含量的增加后期呈現(xiàn)出萎黃和壞死的條紋斑逡逑（圖１－４）邋（ＦａｌｋａｎｄＴｓａｉ，１９９８）。該病毒可侵染８０種禾本科植物帶來嚴(yán)重逡逑危害，除了最適寄主水稻和過冬雜草以外，還可以侵染小麥、看麥娘和早熟禾等逡逑（阮義理等，１９８６；周益軍等，２０１２）。實驗條件下，ＲＳＶ可通過摩檫接種，逡逑侵染實驗?zāi)Ｊ街参锉臼蠠熀蛿M南芥（Ｆｅｎｇ邋ｅ／邋ｃｉ／．，邋２０１１；邋Ｘｉｏｎｇ邋ｅ／邋ｆｌ／．，邋２００８）。逡逑ＭＢ逡逑圖１＞４水稻條紋病毒（ＲＳＶ）侵染水稻產(chǎn)生的癥狀（袁正杰，２０１２）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－４邋Ｓｙｍｐｔｏｍｓ邋ｏｆ邋ｒｉｃｅ邋ｃａｕｓｅｄ邋ｂｙ邋Ｒｉｃｅ邋ｓｔｒｉｐｅ邋ｔｅｎｕｉｖｉｎｉｓ邋（ＲＳＶ）邋（Ｙｕａｎ，邋２０１２）．逡逑在丨８９７年，ＲＳＶ在日本被首次報道，隨后在東亞的許多國家被檢測到，逡逑其中包括中國。１９６０－１９７２年和１９７７－邋１９８６年ＲＳＶ在日本地區(qū)發(fā)生兩次爆逡逑發(fā)，之后由于介體昆蟲灰飛虱的遷入，ＲＳＶ于２００８年在日本西部流行（Ｏｔｕｋａ逡逑ｅｒａ／．
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S432.41

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;水稻條紋病毒通過干擾植物蛋白棕櫚�；焖俳⑶秩拘聶C制[J];種業(yè)導(dǎo)刊;2018年01期

2 劉剛;;中國農(nóng)科院植保所灰飛虱傳播水稻條紋病毒機制研究取得新進展[J];農(nóng)藥市場信息;2015年23期

3 ;揚州大學(xué)研制成功能降解水稻條紋病毒的生物“疫苗”[J];山東農(nóng)藥信息;2007年05期

4 ;我國科學(xué)家探明水稻條紋病毒快速侵染的新機制[J];中國食品學(xué)報;2017年12期

5 張金平;;我國科學(xué)家探明水稻條紋病毒快速侵染的新機制[J];農(nóng)藥市場信息;2018年01期

6 ;科技與產(chǎn)品[J];農(nóng)藥市場信息;2004年15期

7 劉剛;;中英合作水稻條紋病毒sRNA相關(guān)研究取得重大突破[J];農(nóng)藥市場信息;2013年20期

8 熊如意;吳建祥;周益軍;周雪平;;水稻條紋病毒NS2基因原核表達產(chǎn)物多克隆抗體制備及受侵染水稻和灰飛虱體內(nèi)NS2檢測[J];植物病理學(xué)報;2009年01期

9 劉剛;;中科院微生物所在水稻條紋病毒卵傳機制研究中取得進展[J];農(nóng)藥市場信息;2018年08期

10 鄭慶偉;;“水稻條紋病毒侵染相關(guān)的水稻microRNA分離鑒定及應(yīng)用”項目通過驗收[J];農(nóng)藥市場信息;2014年03期

相關(guān)會議論文 前10條

1 周益軍;程兆榜;熊如意;季英華;;水稻條紋病毒與介體灰飛虱互作的相關(guān)研究[A];糧食安全與植�？萍紕�(chuàng)新[C];2009年

2 代玉華;王錫鋒;;抗水稻條紋病毒RNAi載體的構(gòu)建及水稻的遺傳[A];中國植物病理學(xué)會2005年學(xué)術(shù)年會暨植物病理學(xué)報創(chuàng)刊50周年紀(jì)念會論文摘要集[C];2005年

3 程兆榜;劉海建;魏邦慶;周益軍;范永堅;謝聯(lián)輝;;灰飛虱攜帶和傳遞水稻條紋病毒規(guī)律研究[A];中國植物病理學(xué)會2005年學(xué)術(shù)年會暨植物病理學(xué)報創(chuàng)刊50周年紀(jì)念會論文摘要集[C];2005年

4 代玉華;王錫鋒;;抗水稻條紋病毒RNAi載體的構(gòu)建及水稻的遺傳[A];中國植物病理學(xué)會2005年學(xué)術(shù)年會暨植物病理學(xué)報創(chuàng)刊50周年紀(jì)念會論文集[C];2005年

5 程兆榜;劉海建;魏邦慶;周益軍;范永堅;謝聯(lián)輝;;灰飛虱攜帶和傳遞水稻條紋病毒規(guī)律研究[A];中國植物病理學(xué)會2005年學(xué)術(shù)年會暨植物病理學(xué)報創(chuàng)刊50周年紀(jì)念會論文集[C];2005年

6 代玉華;王錫鋒;;一種抗水稻條紋病毒RNAi載體的構(gòu)建[A];中國植物病理學(xué)會2006年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2006年

7 程兆榜;任春梅;魏邦慶;周益軍;范永堅;;水稻條紋病毒致病性及其遺傳多樣性[A];中國植物病理學(xué)會2007年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2007年

8 張曉婷;謝荔巖;林奇英;李洪連;吳祖建;謝聯(lián)輝;;水稻感染水稻條紋病毒后的基因轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)表達譜[A];中國植物病理學(xué)會2008年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2008年

9 周益軍;程兆榜;熊如意;季英華;;水稻條紋病毒與介體灰飛虱互作的相關(guān)研究[A];江蘇省植物病理學(xué)會第十一次會員代表大會暨學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

10 周益軍;程兆榜;熊如意;季英華;;水稻條紋病毒與介體灰飛虱互作的相關(guān)研究[A];植物保護科技創(chuàng)新與發(fā)展——中國植物保護學(xué)會2008年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2008年

相關(guān)重要報紙文章 前3條

1 記者　 張曄　通訊員　 李超;對付水稻條紋病毒有了“生物導(dǎo)彈”[N];科技日報;2007年

2 記者 瞿劍;水稻條紋病毒解除寄主植物防御機理揭示[N];科技日報;2017年

3 楊榮明 徐守濱;臨戰(zhàn)措施：切斷毒鏈、治蟲控病[N];江蘇科技報;2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 袁正杰;水稻條紋病毒編碼的NSvc4蛋白致病機理研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2012年

2 熊如意;水稻條紋病毒基因的原核表達及NS3和NSvc4的功能研究[D];浙江大學(xué);2008年

3 黃凌哲;水稻條紋病毒的分子生物學(xué)研究[D];浙江大學(xué);2011年

4 徐毅;水稻病毒與介體互作研究及水稻條紋病毒編碼蛋白功能研究[D];浙江大學(xué);2013年

5 劉文文;與傳播水稻條紋病毒相關(guān)的灰飛虱蛋白質(zhì)鑒定與功能研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

6 萬貴鈞;病毒和磁場對稻飛虱發(fā)育、生殖及行為的影響研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

7 焦文娟;灰飛虱鞘脂質(zhì)代謝酶與水稻條紋病毒侵染和復(fù)制的關(guān)系[D];浙江大學(xué);2016年

8 魏太云;水稻條紋病毒的基因組結(jié)構(gòu)及其分子群體遺傳[D];福建農(nóng)林大學(xué);2003年

9 程文金;水稻條紋病毒致病性分化與分子變異[D];福建農(nóng)林大學(xué);2009年

10 吳根土;兩種植物病毒編碼的RNA沉默抑制子在寄主體內(nèi)的功能研究[D];浙江大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 丘萍;基于mRNA富集的水稻條紋病毒“帽子序列譜”的獲得與分析[D];福建農(nóng)林大學(xué);2018年

2 陳埔;水稻條紋病毒（RSV）編碼的SP蛋白的結(jié)構(gòu)與功能初探[D];福建農(nóng)林大學(xué);2017年

3 杜晉文;RNAi沉默灰飛虱傳毒相關(guān)蛋白基因抗水稻條紋病毒研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

4 馮耿;水稻條紋病毒脅迫下抗感品種的差異蛋白質(zhì)組研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2017年

5 張超;水稻條紋病毒pc4蛋白的功能鑒定[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2012年

6 王世娟;水稻條紋病毒對灰飛虱胚胎發(fā)育的影響[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

7 廖富榮;水稻條紋病毒及其介體灰飛虱的遺傳多樣性[D];福建農(nóng)林大學(xué);2004年

8 侯艷玲;水稻條紋病毒NSvc2-N與NSvc2-C蛋白互作的研究[D];揚州大學(xué);2013年

9 高鵬;針對水稻條紋病毒的人工miRNA設(shè)計與應(yīng)用[D];浙江師范大學(xué);2010年

10 許存賓;水稻條紋病毒傳播介體灰飛虱的種群遺傳結(jié)構(gòu)分析及其體內(nèi)Wolbachia的檢測[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2012年

本文編號：2641495