【摘要】：水稻條紋病毒(Rice stripetenuivirus,RSV)是白細(xì)病毒科(Phenuiviridae),纖細(xì)病毒屬(Tenuivirus)代表成員,其基因組含4條單鏈RNA,通過(guò)負(fù)義或雙義策略共編碼7個(gè)蛋白。與其它分段負(fù)義RNA病毒(sNSV)一樣,RSV在基因表達(dá)過(guò)程中采用“抓帽”機(jī)制,即從寄主mRNA抓取一段10-20個(gè)堿基的帽子序列,以之作為引物起始轉(zhuǎn)錄,合成5'端含一段異源序列的病毒mRNA。最近,本實(shí)驗(yàn)室利用高通量測(cè)序技術(shù)獲得了 RSVNP和NCPmRNA的帽子序列,為解析RSV的“抓帽”機(jī)制提供了許多新的視角。然而,由于RSV其它mRNA相對(duì)于基因組RNA(或其互補(bǔ)鏈)的含量太低,在經(jīng)過(guò)多次嘗試后,我們無(wú)法獲得它們的帽子序列,因而我們不能確定所得數(shù)據(jù)是否具有偏頗。尤其,我們發(fā)現(xiàn)RSV在合成NP和NCP mRNA時(shí),使用“引發(fā)與重配”(prime-and-realign)機(jī)制的頻率不同,但不確定RSV合成其它mRNA時(shí)是否也存在這種差異。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),eIF4E蛋白能結(jié)合mRNA的帽子結(jié)構(gòu)。已有研究者通過(guò)基因改造,提高了 eIF4E對(duì)帽子結(jié)構(gòu)的親和性。也已有研究者利用eIF4E蛋白突變體(eIF4EK119A)富集含帽子結(jié)構(gòu)的RNA�；诖�,本研究嘗試?yán)胑IF4EK119A富集RSV mRNA,進(jìn)而獲得更完整的RSV帽子序列譜。首先,本研究將eIF4EK119A構(gòu)建到帶GST標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pGEX-4T-3,所得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)Rosseta菌株;通過(guò)優(yōu)化條件(IPTG終濃度為0.25 mMol,16 ℃、180rpm、10-13 h)獲得 eIF4EK119A 蛋白;將 eIF4EK1 19A 蛋白(GST磁珠結(jié)合)與提取自RSV侵染水稻的60μg總RNA混合,以免疫共沉淀的方式獲得富集的mRNA 3 μg;以富集的mRNA為底物,利用本實(shí)驗(yàn)室已建立的技術(shù),先對(duì) RSVNVS2、NSvc2、NS3、NCP 和 NSvc46 種 mRNA 的 5'端進(jìn)行了傳統(tǒng)的克隆和測(cè)序。結(jié)果表明,所得序列90%含帽子序列,這表明本研究成功以 eIF4EK119A 富集了 RSV mRNA。本研究接著以富集的RSV mRNA為材料,利用Cap-seq技術(shù),獲取了NS2、NSvc2、NS3、NP、NCP和 NSvc4 6 種 mRNA 的“帽子序列譜”,分析結(jié)果表明:(1)在合成各mRNA時(shí),RSV的“抓帽”模式無(wú)明顯差異;(2)RSV在轉(zhuǎn)錄病毒鏈時(shí)比轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)鏈時(shí)更頻繁地使用“引發(fā)與重配”機(jī)制,其結(jié)果是RSV病毒鏈的轉(zhuǎn)錄物比互補(bǔ)鏈的轉(zhuǎn)錄物具有更長(zhǎng)和更復(fù)雜的帽子序列。本研究利用eIF4EK119A蛋白實(shí)現(xiàn)了 RSVmRNA的富集,并在此基礎(chǔ)上,首次獲得了一個(gè)較為完整的RSV“帽子序列譜”。以此為基礎(chǔ),本研究首次表明RSV在轉(zhuǎn)錄病毒鏈時(shí)比轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)鏈時(shí)更頻繁地使用“引發(fā)與重配”機(jī)制,這為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)RSV的“抓帽”機(jī)理邁出了重要一步。
【圖文】：

結(jié)構(gòu)；而多分體負(fù)義ＲＮＡ病毒普遍采用的一種策略是，從寄主那里奪取一段含逡逑帽子結(jié)構(gòu)的ＲＮＡ序列，來(lái)作為引物起始自身ｍＲＮＡ的轉(zhuǎn)錄（Ｄｅｃｒｏｌｙｅ／ａ／．，逡逑２０１２），生成５＇端含有一段“異源”帽子序列（來(lái)源于寄主，如圖１邋－邋１邋）的病逡逑毒ｍＲＮＡ邋（ＤｅｃｒｏｌｙｅＭ／．，，２０１１），該過(guò)程被稱為“抓帽”機(jī)制。逡逑５，邐？丨丨＿丨｜＇逡逑丨邋丨邐邐｜逡逑ｙ邐ｙ逡逑異源帽子序列邐病毒序列逡逑圖卜１邋“抓帽”病毒的ｍＲＮＡ結(jié)構(gòu)。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｍＲＮＡ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ａ邋“ｃａｐ－ｓｎａｔｃｈｉｎｇ”邋ｖｉｒｕｓ邋．逡逑１．１．１邐“抓帽”機(jī)制在流感病毒上的發(fā)現(xiàn)逡逑“抓帽”最早發(fā)現(xiàn)于感病毒。早在上世紀(jì)７０年代中后期，研究者就發(fā)現(xiàn)逡逑了一些相關(guān)的證據(jù)，并最終揭示了這一現(xiàn)象：（１）寄主的聚合酶ＩＩ邋（Ｐｏ丨ＩＩ）逡逑活性影響流感病毒的侵染和增殖（Ｓｐｏｏｎｅｒ邋ａｎｄ邋Ｒｉｃｈａｒｄ，邋１９７７）邋；邐（２）雖然體內(nèi)逡逑合成的流感病毒ｍＲＮＡ含有帽子結(jié)構(gòu)，提純的流感病毒粒子卻無(wú)加帽活性逡逑（Ｋｒｕｇｅ／？／．，邋１９７６；邋Ｐｌｏｔｃｌｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋１９７８）邋；邐（３）在體外轉(zhuǎn)錄體系中，加入含帽子逡逑結(jié)構(gòu)的ｍＲＮＡ能顯著提高流感病毒的轉(zhuǎn)錄活性（Ｂｏｕｌｏｙｅ／？／．

型方式傳播并且可經(jīng)卵垂直傳播給下一代，被感染的水稻植株葉片早期出現(xiàn)與葉逡逑脈平行的淺綠色條紋斑，隨著病毒含量的增加后期呈現(xiàn)出萎黃和壞死的條紋斑逡逑（圖１－４）邋（ＦａｌｋａｎｄＴｓａｉ，１９９８）。該病毒可侵染８０種禾本科植物帶來(lái)嚴(yán)重逡逑危害，除了最適寄主水稻和過(guò)冬雜草以外，還可以侵染小麥、看麥娘和早熟禾等逡逑（阮義理等，１９８６；周益軍等，２０１２）。實(shí)驗(yàn)條件下，ＲＳＶ可通過(guò)摩檫接種，逡逑侵染實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ街参锉臼蠠熀蛿M南芥（Ｆｅｎｇ邋ｅ／邋ｃｉ／．，邋２０１１；邋Ｘｉｏｎｇ邋ｅ／邋ｆｌ／．，邋２００８）。逡逑ＭＢ逡逑圖１＞４水稻條紋病毒（ＲＳＶ）侵染水稻產(chǎn)生的癥狀（袁正杰，２０１２）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－４邋Ｓｙｍｐｔｏｍｓ邋ｏｆ邋ｒｉｃｅ邋ｃａｕｓｅｄ邋ｂｙ邋Ｒｉｃｅ邋ｓｔｒｉｐｅ邋ｔｅｎｕｉｖｉｎｉｓ邋（ＲＳＶ）邋（Ｙｕａｎ，邋２０１２）．逡逑在丨８９７年，ＲＳＶ在日本被首次報(bào)道，隨后在東亞的許多國(guó)家被檢測(cè)到，逡逑其中包括中國(guó)。１９６０－１９７２年和１９７７－邋１９８６年ＲＳＶ在日本地區(qū)發(fā)生兩次爆逡逑發(fā)，之后由于介體昆蟲灰飛虱的遷入，ＲＳＶ于２００８年在日本西部流行（Ｏｔｕｋａ逡逑ｅｒａ／．
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S432.41

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本文編號(hào)：2641495