【摘要】：蛻皮激素是昆蟲生長發(fā)育過程中的一種重要激素,其合成與信號(hào)傳導(dǎo)過程主要由Halloween基因與一系列下游受體參與完成,明確昆蟲蛻皮激素滴度的變化趨勢(shì)及其合成與信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)基因的表達(dá)規(guī)律,對(duì)進(jìn)一步闡明其對(duì)昆蟲生長、發(fā)育、生殖的調(diào)控機(jī)制具有重要生物學(xué)意義。然而,作為玉米主要害蟲之一的勞氏粘蟲Mythimna loreyi在蛻皮激素方面的研究尚屬空白。鑒于此,本論文以勞氏粘蟲為研究對(duì)象,對(duì)其蛻皮激素合成通路的5個(gè)Halloween基因(Cyp307a1、Cyp306a1、Cyp302a1、Cyp315a1、Cyp314a1)和3個(gè)下游受體基因(EcR、USP、HR3)進(jìn)行克隆,并在此基礎(chǔ)上明確了這些基因在勞氏粘蟲5、6齡幼蟲期、蛹期及成蟲期的表達(dá)及其與20E滴度變化的關(guān)系,同時(shí)探討了成蟲期20E滴度變化與產(chǎn)卵量之間的關(guān)系。取得的主要結(jié)果如下:1、克隆獲得參與勞氏粘蟲蛻皮激素合成過程的5個(gè)Halloween基因(Cyp307a1、Cyp306a1、Cyp302a1、Cyp315a1、Cyp314a1)和3個(gè)蛻皮激素受體基因(EcR、USP、HR3)。5個(gè)Halloween基因中,Cyp306a1、Cyp302a1、Cyp314a1獲得完整開放閱讀框;Cyp307a1、Cyp315a1獲得主要片段;其推導(dǎo)氨基酸序列均具P450超家族保守結(jié)構(gòu)域;系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果表明,5個(gè)Halloween基因分別與其他昆蟲相應(yīng)的同源序列聚在一起,形成5個(gè)分支。3個(gè)蛻皮激素受體基因中,USP和HR3獲得完整開放閱讀框;EcR獲得主要片段;其推導(dǎo)氨基酸序列均具DBD與LBD保守結(jié)構(gòu)域(但因EcR缺少3′端,故LBD結(jié)構(gòu)域不完整);系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示,EcR與小地老虎聚在一支,USP和HR3與棉鈴蟲聚在一支。2、Halloween基因及相關(guān)受體基因的表達(dá)特點(diǎn)分析表明:(1)幼蟲期:5個(gè)Halloween基因和3個(gè)蛻皮激素受體基因在5、6齡幼蟲不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量基本呈周期性變化,其中Halloween基因在5、6齡幼蟲中均是后期高,前期低;EcR與USP在6齡幼蟲的表達(dá)量顯著高于其在5齡幼蟲的表達(dá)量,而HR3則與之相反。(2)蛹期:5個(gè)Halloween基因在勞氏粘蟲雌、雄蛹不同時(shí)期均有表達(dá),但表達(dá)規(guī)律及不同時(shí)期表達(dá)量不同。雌蛹中,各基因均在初化蛹與化蛹后216h時(shí)有較高表達(dá)量,整體表達(dá)規(guī)律較為相似,呈先下降后上升趨勢(shì)。其中,Cyp307a1在初化蛹時(shí)表達(dá)量最高,顯著高于其他時(shí)期;Cyp314a1在化蛹72h時(shí)表達(dá)量最高,顯著高于其他時(shí)期;Cyp306a1、Cyp302a1、Cyp315a1均在化蛹72h時(shí)表達(dá)量最低,216h時(shí)最高,二者之間差異顯著;EcR和USP各時(shí)期表達(dá)量差異顯著;HR3在初化蛹時(shí)表達(dá)量較低,化蛹216h時(shí)表達(dá)量最高,二者間存在顯著性差異。雄蛹中,除Cyp307a1外,其他4個(gè)Halloween基因的表達(dá)量均呈先上升后下降趨勢(shì);其中,Cyp306a1、Cyp302a1、Cyp315a1均在化蛹168h時(shí)表達(dá)量最高,顯著高于其他時(shí)期;Cyp314a1雖在化蛹120h時(shí)表達(dá)量最高,但與72h、168h之間差異不顯著。EcR、USP、HR3基因表達(dá)模式較為相似,均在化蛹168h時(shí)出現(xiàn)表達(dá)量峰值,至216h時(shí)降至較低水平,差異顯著。(3)成蟲期:5個(gè)Halloween基因及3個(gè)受體基因在雌、雄成蟲各發(fā)育時(shí)期均有表達(dá),且雌、雄間差異顯著。3、Halloween基因及相關(guān)受體基因的組織表達(dá)分析結(jié)果顯示:Cyp307a1、Cyp306a1、Cyp302a1、Cyp315a1均在前胸腺中表達(dá)量最高,其他組織中較低;Cyp314a1在馬氏管中特異性高表達(dá)。EcR、USP、HR3均在馬氏管中表達(dá)量最高,前胸腺中表達(dá)量最低,前者分別是后者的9.05、79.20、13.05倍。4、不同發(fā)育時(shí)期20E滴度測(cè)定結(jié)果表明:幼蟲期,5、6齡幼蟲發(fā)育后期20E滴度較前期高;蛹期,初化蛹時(shí)20E滴度最高,化蛹后120h降至最低,之后又上升至較高水平;成蟲期,20E滴度在成蟲羽化48h之內(nèi)一直維持在較低水平,羽化后72h出現(xiàn)一個(gè)小高峰,羽化后96h出現(xiàn)最低值,之后又基本回升至羽化72h時(shí)的水平。5、不同發(fā)育時(shí)期20E滴度與相關(guān)基因表達(dá)模式間的關(guān)系分析結(jié)果表明:勞氏粘蟲幼蟲、蛹、成蟲期20E滴度變化與基因表達(dá)量有較強(qiáng)的相關(guān)性;幼蟲期與蛹期,除Cyp314a1外,其他基因表達(dá)量變化與20E滴度變化趨勢(shì)相似,均為各齡初期低,后期高;但各基因在6齡幼蟲的表達(dá)高峰與20E滴度峰值并不一致,而是前者較后者提前,此現(xiàn)象在蛹期也有出現(xiàn)。成蟲羽化前期20E滴度較后期低,最大值出現(xiàn)在羽化后120h,Cyp307a1、Cyp302a1、Cyp315a1和HR3表達(dá)量變化趨勢(shì)與之相似;與20E滴度在整個(gè)成蟲期波動(dòng)較大不同,Cyp314a1雖在羽化前期表達(dá)量較后期高,但在整個(gè)成蟲期變化不大。6、雌成蟲20E滴度與產(chǎn)卵量的關(guān)系分析結(jié)果表明:雌成蟲20E滴度具兩個(gè)高峰,第一個(gè)小高峰在羽化后72h,此時(shí)對(duì)應(yīng)成蟲產(chǎn)卵初期,隨日產(chǎn)卵量高峰的出現(xiàn),20E滴度降至最低值,二者趨勢(shì)相反,24h后20E滴度又迅速上升至最高值,此時(shí)日產(chǎn)卵量開始呈下降趨勢(shì);表明20E參與成蟲生殖過程,且高滴度的20E可能對(duì)產(chǎn)卵有抑制作用,較低滴度20E則促進(jìn)產(chǎn)卵。
【圖文】：

第二章 勞氏粘蟲 Halloween 基因與蛻皮激素相關(guān)受體基因克隆與序列分析yp314a1），其中 Cyp306a1、Cyp302a1、Cyp314a1 獲得完整開放閱讀框，長度分別620 bp、1530 bp、1551 bp，分別編碼 539、509、516 個(gè)氨基酸殘基；Cyp307a1、Cyp31得主要片段，，長度分別為 1275 bp、1185 bp，分別編碼 425、395 個(gè)氨基酸殘基。（https://web.expasy.org/protparam/ ）網(wǎng)站預(yù)測(cè) Cyp306a1、Cyp302a1、Cyp314a1論等電點(diǎn)（pI）分別為 6.56、9.23、9.03，蛋白分子量（MM）分別為 61.48 kDa、58Da、58.15 kDa；結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明，以上 5 個(gè)基因的氨基酸序列均具 P450 超家守結(jié)構(gòu)域（圖 2.1）；氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，Cyp306a1、Cyp302a1、Cyp315a1yp314a1 的 5 個(gè) P450 結(jié)構(gòu)單元（Helix-C、Helix-I、Helix-K、PERF motif 及 Heme-bindomains）在不同物種間高度保守，但 Cyp307a1 的 Helix-C 和 Helix-I 結(jié)構(gòu)域不保守（.2 至圖 2.6）；系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示，勞氏粘蟲 5 個(gè) Halloween 基因的氨基酸序與其他昆蟲的同源序列聚在一起，形成 5 個(gè)分支，且與甘藍(lán)夜蛾 Mamestra brassi緣關(guān)系最近（圖 2.7）。

但 Cyp307a1 的 Helix-C 和 Helix-I 結(jié)構(gòu)域不保守（圖2.2 至圖 2.6）；系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示，勞氏粘蟲 5 個(gè) Halloween 基因的氨基酸序列均與其他昆蟲的同源序列聚在一起，形成 5 個(gè)分支，且與甘藍(lán)夜蛾 Mamestra brassicae親緣關(guān)系最近（圖 2.7）。圖 2.1 勞氏粘蟲 5 個(gè) Halloween 基因的保守結(jié)構(gòu)域Fig 2.1 Predicted conserved domain of 5 Halloween genes of Mythimna loreyi
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S433.4

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本文編號(hào)：2640682