發(fā)布時間：2020-04-25 16:00

【摘要】：柑桔黃龍病是柑桔產業(yè)的毀滅性病害,而柑桔木虱Diaphorina citri Kuwayama是傳播柑桔黃龍病病菌Candidatus Liberibacter asiaticus的主要媒介。由于迄今尚未發(fā)現能有效防治柑桔黃龍病的藥劑,因此對傳播媒介柑桔木虱的防治是控制柑桔黃龍病田間傳播與擴散最為有效的措施。當前,化學防治是防控柑桔木虱最主要的方法。此外,基于高效誘殺柑桔木虱的綠色防控技術研發(fā)是各國學者關注的熱點。本學位論文利用柑桔木虱基因組和觸角轉錄組數據,采用RT-qPCR的方法解析柑桔木虱嗅覺受體在不同氣味刺激以及在不同發(fā)育階段的表達模式,為發(fā)掘潛在的分子靶標奠定基礎。同時采用RT-PCR方法克隆柑桔木虱嗅覺受體基因DcitOR18和DcitOrco的cDNA全長序列,通過共轉染進入異源表達系統(tǒng)(HEK293細胞),利用鈣離子成像技術初步探究柑桔木虱嗅覺受體DcitOR18對月桂烯的結合活性。研究成果為揭示柑桔木虱嗅覺受體的靶標潛力以及為研制新型的引誘劑或趨避劑防控柑桔木虱提供一定的基礎數據。主要研究結果如下:1柑桔木虱嗅覺受體基因表達模式解析柑桔木虱經5%月桂烯和5%丁酸乙酯分別刺激5 h,采用RT-qPCR方法解析40個嗅覺受體基因的表達模式。結果顯示,共有8個嗅覺受體基因對兩種氣味物質的刺激產生反應。其中,在5%月桂烯刺激下,7個嗅覺受體基因的表達量出現下調,包括DcitOR4、DcitOR7、DcitOR9、DcitOR17、DcitOR18、DcitOR21和DcitOR28。在5%丁酸乙酯刺激下,僅有2個嗅覺受體基因DcitOR18和DcitOR46表達量下調。值得注意的是,相比于丁酸乙酯,柑桔木虱經月桂烯刺激后表達下調的嗅覺受體基因更多,說明柑桔木虱對柑桔揮發(fā)物月桂烯的刺激更為敏感。除此之外,DcitOR18對月桂烯和丁酸乙酯的刺激均產生反應,說明DcitOR18可能在柑桔木虱嗅覺系統(tǒng)具有重要作用。進一步采用實時熒光定量PCR解析非典型嗅覺受體基因DcitOrco和8個候選嗅覺受體基因在柑桔木虱不同發(fā)育階段的表達模式。結果發(fā)現,DcitOrco在若蟲和成蟲期的表達量較低且相對穩(wěn)定,而其余8個候選DcitORs在柑桔木虱各發(fā)育階段均有表達,且在3-4齡若蟲期表達量最高,暗示這些嗅覺受體可能在柑桔木虱3-4齡若蟲期發(fā)揮重要作用。2柑桔木虱嗅覺受體基因DcitOR18和DcitOrco的cDNA克隆基于柑桔木虱基因組和觸角轉錄組數據,采用RT-PCR技術,克隆獲得柑桔木虱嗅覺受體DcitOR18和DcitOrco的cDNA全長序列。其中,DcitOR18含有1401個核苷酸,編碼467個氨基酸,DcitOrco含有1386個核苷酸,編碼461個氨基酸。利用TMHMM預測跨膜結構域,結果顯示DcitOR18僅有4個跨膜區(qū),而DcitOrco有7個跨膜區(qū),符合非典型嗅覺受體的結構特征。多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現,不同昆蟲嗅覺受體Orco的氨基酸序列高度保守,同源性高達70%,柑桔木虱DcitOrco在進化上亦較為保守,其親緣關系與蚜蟲的Orco更為接近。3柑桔木虱嗅覺受體DcitOR18和DcitOrco異源表達及功能驗證通過改造哺乳動物表達載體pcDNA3.1(+),融入mcherry紅色熒光蛋白基因,構建了表達載體pcDNA3.1(+)-mcherry。將柑桔木虱DcitOR18和DcitOrco分別插入該載體,成功構建了pcDNA3.1m(+)-DcitOrco和pcDNA3.1m(+)-DcitOR18表達質粒。將重組質粒pcDNA3.1(+)-mcherry轉染HEK293細胞,檢測到紅色熒光信號,表明HEK293細胞表達mcherry紅色熒光蛋白。進一步將上述兩個表達質粒共轉染進入HEK293細胞,利用鈣離子成像技術,發(fā)現當加入月桂烯刺激時,細胞的熒光明顯增強,而僅轉染重組質粒pcDNA3.1(+)-mcherry時,HEK293細胞熒光雖有所增強,但比共轉染兩種重組質粒pcDNA3.1m(+)-DcitOrco和pcDNA3.1m(+)-DcitOR18時弱。為進一步確定這一關系,構建HEK293細胞穩(wěn)定表達DcitOrco株系,在mRNA水平檢測發(fā)現HEK293細胞過表達DcitOrco,達1400倍,但在蛋白水平未檢測到DcitOrco的表達,這為全面解析柑桔木虱嗅覺受體的功能奠定了基礎。
【圖文】：

圖 1.1 柑桔木虱卵及若蟲（1-5th）外部形態(tài)Fig 1.1 Morphological feature of Diaphorina citri from egg to nymphs (1-5th). 柑桔木虱傳播柑桔黃龍病柑桔黃龍病病菌 Candidatus Liberibacter 屬于原核生物變形菌門變形菌綱韌皮部屬，目前普遍認為黃龍病病菌屬于革蘭氏陰性菌[8]。根據黃龍病病原菌的熱敏感分為耐熱型的亞洲種（Candidatus Liberibacter asiaticus，Las）和美洲種（Candideribacter americanus，Lam）以及熱敏感型的非洲種（Candidatus Liberibacter africanf）。目前研究發(fā)現亞洲柑桔木虱可傳播亞洲種和美洲種，而非洲柑桔木虱傳播非洲柑桔木虱傳播柑桔黃龍病可分為獲取病原菌（acquisition access period,AAP）、潛latency period，，LP，病原菌進入柑桔木虱的唾液腺）以及接種（inoculation access peP）三個階段[1]。先前的研究表明，柑桔木虱獲取病原菌所需時間為 15 min 至 1 潛伏期為 1-25 d，接種所需時間為 15 min 至 7 h[1]。隨著科學技術的發(fā)展，PCR 和 qP

圖 1.2 昆蟲嗅覺生理過程模式圖（引自 Sánchezgracia[42]）Fig 1.2 Schematic of insect olfactory physiology process (originating from Sánchezgracia).2 昆蟲嗅覺受體的鑒定和特性1991 年，Buck 和 Axel 首次在褐家鼠 Rattus norvegicus 鼻粘膜上鑒定了大量的體，揭開了哺乳動物嗅覺感受之謎[48]。而昆蟲嗅覺受體的發(fā)現較滯后，直到rosophila melanogaster 基因組測序完成之后才鑒定出 62 個果蠅嗅覺受體[49-51]。隨
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S436.66

【參考文獻】

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本文編號：2640419