【摘要】：蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thutingiensis,Bt)因其產(chǎn)生的多種殺蟲(chóng)活性物質(zhì)而被廣泛應(yīng)用于害蟲(chóng)防治中。本研究中所使用的Cry1Ai2和Cry1Ah1為本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的對(duì)多種鱗翅目害蟲(chóng)均存在良好殺蟲(chóng)活性的蛋白。前期研究結(jié)果表明Cry1Ai與Cry1Ah蛋白對(duì)棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera)和家蠶(Bombyx mori)的活性均存在顯著差異,而將Cry1Ah蛋白的loop2換到Cry1Ai蛋白(LC_(50)500μg/g)相應(yīng)位置后獲得的突變體Cry1Ai-h-loop2對(duì)棉鈴蟲(chóng)的生物活性顯著提升(LC_(50)=64.23μg/g),將loop2和loop3同時(shí)替換后獲得的Cry1Ai-h-loop23對(duì)棉鈴蟲(chóng)的活性進(jìn)一步上升(LC_(50)=8.61μg/g)。在此基礎(chǔ)上,本研究的主要內(nèi)容主要包括兩方面,首先以突變體Cry1Ai-h-loop2為出發(fā)材料,分析找到loop2上的關(guān)鍵位點(diǎn),再對(duì)這些位點(diǎn)定點(diǎn)突變,分析突變體對(duì)棉鈴蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性變化;其次分析Cry1Ai蛋白domain II上loop2和loop3在對(duì)家蠶殺蟲(chóng)活性中發(fā)揮的作用,同時(shí)測(cè)定關(guān)鍵loop區(qū)域的替換突變體對(duì)家蠶和其它鱗翅目害蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性。本研究的主要結(jié)果如下:1.通過(guò)丙氨酸突變和對(duì)棉鈴蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性測(cè)定后發(fā)現(xiàn),Gly~(373)和Asn~(375)位點(diǎn)是Cry1Ai-h-loop2蛋白loop2上的關(guān)鍵位點(diǎn)。將這兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)替換為丙氨酸后,雙點(diǎn)突變體對(duì)棉鈴蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性和與棉鈴蟲(chóng)中腸刷狀緣膜囊泡的結(jié)合能力均顯著下降。2.對(duì)功能位點(diǎn)Gly~(373)和Asn~(375)進(jìn)行另外18種常見(jiàn)蛋白質(zhì)氨基酸的替換突變后,未發(fā)現(xiàn)對(duì)棉鈴蟲(chóng)活性顯著提高的突變體,說(shuō)明這個(gè)loop上的氨基酸序列可能是最佳的天然組合。3.通過(guò)測(cè)定Cry1Ai、Cry1Ah以及兩種蛋白domain II上loop區(qū)域突變體對(duì)家蠶的殺蟲(chóng)活性后發(fā)現(xiàn),Cry1Ai蛋白的loop2不決定蛋白對(duì)家蠶的殺蟲(chóng)特異性,而loop3對(duì)蛋白殺蟲(chóng)活性的發(fā)揮十分重要,且loop2和loop3對(duì)家蠶殺蟲(chóng)活性的變化具有相加作用。同時(shí),將Cry1Ai蛋白的loop2和loop3同時(shí)替換后,突變體Cry1Ai-h-loop23對(duì)家蠶的活性降低了17倍,差異顯著。綜合本實(shí)驗(yàn)室之前的研究結(jié)果(Cry1Ai-h-loop23蛋白對(duì)棉鈴蟲(chóng)具有很高的殺蟲(chóng)活性),根據(jù)作用機(jī)理的基礎(chǔ)進(jìn)行蛋白的定向改造后,我們最終獲得了對(duì)棉鈴蟲(chóng)殺蟲(chóng)活性提高、對(duì)家蠶活性下降的突變體蛋白—Cry1Ai-h-loop23。4.通過(guò)ELISA結(jié)合分析證明:突變體Cry1Ai-h-loop23與家蠶BBMV的結(jié)合能力下降,這可能是蛋白活性下降的原因之一,同時(shí)說(shuō)明loop2和loop3參與蛋白與家蠶BBMV的結(jié)合中。5.突變體Cry1Ai-h-loop23對(duì)小菜蛾仍具一定的殺蟲(chóng)活性,但與Cry1Ai蛋白的活性相比,突變體的殺蟲(chóng)活性顯著降低。本研究鑒定了對(duì)棉鈴蟲(chóng)活性顯著上升的突變體Cry1Ai-h-loop2上的關(guān)鍵位點(diǎn),同時(shí)分析了Cry1Ai蛋白上與家蠶殺蟲(chóng)活性相關(guān)的loop區(qū)域,并篩選到對(duì)家蠶活性顯著下降的Cry1Ai蛋白突變體。這些研究將為Cry蛋白的殺蟲(chóng)機(jī)理研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),同時(shí)也為安全、高效、特異的Cry蛋白的理性設(shè)計(jì)與定向改造提供了新的思路。
【圖文】：

士學(xué)位論文 第一章 引 言芽胞桿菌概述芽胞桿菌的特征桿菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，在菌體的生長(zhǎng)周期中能產(chǎn)生芽胞和伴胞環(huán)境中普遍存在，可從昆蟲(chóng)、土壤、儲(chǔ)藏品及塵埃、污水和植被菌在發(fā)現(xiàn)之初被認(rèn)為是一種昆蟲(chóng)病原物，并且發(fā)現(xiàn)它的殺蟲(chóng)活性., 1998）。伴胞晶體也稱為殺蟲(chóng)晶體蛋白(Insecticidal crystal proteins一種殺蟲(chóng)蛋白——包括 Cry 蛋白和 Cyt 蛋白。一旦昆蟲(chóng)攝入蛋白解并被中腸蛋白酶活化，活化后的蛋白與中腸細(xì)胞膜的特定受體死亡（Bravo et al., 2007）。

圖 1.2 蘇云金芽胞桿菌的功能介紹（Jouzani et al., 2017）Figure 1.2 The known functions of Bt (Jouzani et al., 2017).2 Cry 蛋白簡(jiǎn)介2.1 Cry 蛋白的殺蟲(chóng)活性與分類Cry 蛋白是一種由蘇云金芽胞桿菌產(chǎn)生的伴胞晶體蛋白，其特點(diǎn)為對(duì)靶標(biāo)生物體存在實(shí)驗(yàn)上證實(shí)的生物活性，并且與已知的 Cry 蛋白具有一定序列相似性的蛋白質(zhì)也可稱作 Cry 蛋白Crickmore et al., 1998）。自 1981 年 Schnepfh 等人利用 DNA 重組技術(shù)從庫(kù)斯塔克亞種 HD-1 菌中克隆出第一個(gè)殺蟲(chóng)晶體蛋白基因起（Schnepf and Whiteley, 1981），至 2018 年 5 月，已獲得命的 cry 基因共計(jì) 802 個(gè)（http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/）�，F(xiàn)行的 Cry白命名法則由 Crickmore 等人提出，即蛋白的命名只考慮不同 Cry 蛋白間的氨基酸序列相似性不考慮其殺蟲(chóng)譜的相似性。一種 Cry 蛋白的名稱由 4 個(gè)等級(jí)構(gòu)成，1 級(jí)使用阿拉伯?dāng)?shù)字表示且似性要小于 45%，2 級(jí)使用大寫(xiě)英文字母表示且相似性要在 45%-78%之間，3 級(jí)使用小寫(xiě)英文母表示且相似性要在 78%-95%之間，4 級(jí)使用阿拉伯?dāng)?shù)字表示且相似性要大于 95%（Crickmoreal., 1998）。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S476

【參考文獻(xiàn)】

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1 王澤宇;周子珊;何康來(lái);束長(zhǎng)龍;宋福平;張杰;;亞洲玉米螟對(duì)Cry9Ee與Cry1Ab蛋白的交互抗性分析[J];中國(guó)生物防治學(xué)報(bào);2015年06期

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本文編號(hào)：2637344