【摘要】：植物彈狀病毒(rhabdoviruses)是一類基因組為負(fù)鏈RNA的囊膜病毒(envelopedviruses),廣泛為害多種糧食和經(jīng)濟(jì)作物,引起嚴(yán)重產(chǎn)量損失�？嘬牟它S網(wǎng)病毒(Sonchus yellow net virus,SYNV)在分類上屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)細(xì)胞核彈狀病毒屬(Nucleorkibabdovirus),是目前研究較為深入的植物彈狀病毒。SYNV在細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制,病毒粒子從內(nèi)核膜(inner nuclear membrane)出芽后富集于核周腔(perinuclearspace)。侵染植物、昆蟲、魚類和脊椎動(dòng)物等不同寄主的彈狀病毒均以3'-N-P-M-G-L-5'的順序編碼五個(gè)保守的病毒結(jié)構(gòu)蛋白,且在基因組復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、出芽(budding)和病毒粒子形成等過程具有類似的特性。此外,植物彈狀病毒還編碼了一個(gè)額外的非結(jié)構(gòu)蛋白,即植物彈狀病毒擴(kuò)散侵染所必須的運(yùn)動(dòng)蛋白(movement protein,MP)。長(zhǎng)久以來由于反向遺傳學(xué)體系的缺失,學(xué)界對(duì)于植物彈狀病毒的運(yùn)動(dòng)機(jī)制知之甚少。本研究以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的植物彈狀病毒侵染性克隆為基礎(chǔ),以SYNV為重點(diǎn)研究對(duì)象,探索了病毒胞間運(yùn)動(dòng)和長(zhǎng)距離運(yùn)動(dòng)模式,以及超侵染排阻(superinfectionexclusion,SIE)等現(xiàn)象的分子機(jī)制。為了明確SYNV胞間運(yùn)動(dòng)方式,我們構(gòu)建一系列SYNV缺失突變體,包括非結(jié)構(gòu)蛋白sc4、病毒基質(zhì)蛋白(matrix protein,M)、糖蛋白(Glycoprotein,G)以及M蛋白和G蛋白雙缺失突變體,并分析了這些缺失突變體病毒的胞間運(yùn)動(dòng)能力。研究結(jié)果表明,sc4為SYNV的運(yùn)動(dòng)蛋白,其缺失導(dǎo)致SYNV喪失胞間運(yùn)動(dòng)能力;M、G以及M和G雙缺失突變體依然具有有限的胞間運(yùn)動(dòng)能力,從而明確了 SYNV的最小運(yùn)動(dòng)單位是其病毒核蛋白(nucleoprotein,N)、磷蛋白(phosphoprotein,P)和RNA聚合酶(Large polymerase,L)蛋白包裹基因組形成的核衣殼(nucleocapsid,NC)。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn),瞬時(shí)表達(dá)的SYNVsc4蛋白主要定位于本氏煙表皮細(xì)胞的細(xì)胞周質(zhì)(cell periphery),在細(xì)胞核內(nèi)也有少許分布。sc4和高爾基體marker ManI-mCherry、ER 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的marker GFP-HDEL、細(xì)胞骨架微管marker MAP65-RFP以及細(xì)胞骨架微絲marker ABD2-GFP均沒有顯著的共定位。利用抑制蛋白分泌系統(tǒng)和細(xì)胞骨架的藥物進(jìn)行處理發(fā)現(xiàn),20μg/ml的布雷非德菌素A(Brefeldin A,BFA)可以通過破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)腔結(jié)構(gòu)來抑制SYNV胞間運(yùn)動(dòng),而微管抑制劑氨黃樂靈(Oryzalin)和微絲解聚劑拉春庫(kù)林B(Latrunculin B,Lat B)則對(duì)SYNV胞間運(yùn)動(dòng)沒有影響。與SYNVN、P蛋白一樣,sc4也具有體外非特異性結(jié)合單鏈RNA的能力。BiFC和酵母雙雜交均發(fā)現(xiàn)sc4與主要核衣殼蛋白N和P蛋白存在互作。我們利用彈狀病毒SYNV、馬鈴薯黃矮病毒(Potato yellow dwarf virus,PYDV)、水稻黃矮病毒(Rice yellow stunt virus,RYSV)、水稻條紋花葉病毒(Rice yellow stunt virus,RSMV)和番茄黃斑駁相關(guān)病毒(Tomato yellow mottle-associated virus,TYMaV)編碼的MP,分別成功回補(bǔ)了番茄花葉病毒運(yùn)動(dòng)蛋白缺失突變體(ToMV-GFPΔMP)和馬鈴薯X病毒運(yùn)動(dòng)蛋白缺失突變體(PVX-GFPΔp25)的胞間運(yùn)動(dòng),表明彈狀病毒的運(yùn)動(dòng)蛋白和正鏈RNA病毒的運(yùn)動(dòng)蛋白有功能上的相似性。對(duì)SYNV運(yùn)動(dòng)蛋白缺失突變體(rSYNV-GFPΔsc4)進(jìn)行反式互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),除了其自身編碼的sc4運(yùn)動(dòng)蛋白,其它彈狀病毒如PYDV、RYSV、RSMV和TYMaV編碼的MP以及黃瓜花葉病毒(Cucumbber mosaic virus,CMV)、煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、水稻條紋病毒(Rice stripe virus,RSV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)、番茄叢矮病毒(Tomato bushy stunt virus,TBSV)、番茄花葉病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)病毒編碼的MP都無法回補(bǔ)rSYNV-GFPΔsc4的運(yùn)動(dòng)。同樣的,對(duì)于細(xì)胞質(zhì)彈狀病毒——TYMaV來說,僅其自身編碼的P3可以回補(bǔ)rTYMaV-GFPΔP3的運(yùn)動(dòng),表明彈狀病毒胞間運(yùn)動(dòng)特異性地依賴于其自身編碼的MP。蛋白互作分析表明,SYNV和TYMaV MP僅與自身N蛋白互作,而不與異源N蛋白互作,推測(cè)正是這種核衣殼蛋白與運(yùn)動(dòng)蛋白間的特異性互作導(dǎo)致異源病毒編碼的MP無法回補(bǔ)彈狀病毒胞間運(yùn)動(dòng)。進(jìn)一步共表達(dá)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),sc4能夠幫助SYNVN-P復(fù)合體從核內(nèi)復(fù)制位點(diǎn)定位到細(xì)胞周邊類似PD的結(jié)構(gòu)上,而不能互作的異源病毒MP則無法改變SYNVN-P復(fù)合體定位。這些結(jié)果表明,彈狀病毒MP通過與核衣殼蛋白特異性互作,引導(dǎo)后者胞內(nèi)和胞間運(yùn)動(dòng)。目前對(duì)于植物病毒長(zhǎng)距離運(yùn)動(dòng)的認(rèn)識(shí)主要基于正鏈RNA病毒的相關(guān)研究,而我們對(duì)于植物負(fù)鏈RNA包膜病毒長(zhǎng)距離運(yùn)動(dòng)的方式和機(jī)制了解甚少。我們利用SYNV反向遺傳學(xué)系統(tǒng)對(duì)病毒的結(jié)構(gòu)蛋白融合熒光標(biāo)簽,并對(duì)SYNV侵染的本氏煙葉柄、莖稈和根部等維管組織進(jìn)行徒手切片和超薄切片,通過共聚焦顯微鏡和透射電鏡跟蹤和觀察病毒蛋白以及病毒粒子的組織定位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SYNV可在韌皮部復(fù)制并進(jìn)行長(zhǎng)距離運(yùn)輸;完整的病毒粒子或結(jié)構(gòu)蛋白存在于本氏煙韌皮部和木質(zhì)部薄壁細(xì)胞、甚至木質(zhì)部導(dǎo)管等組分中,但沒有直接的證據(jù)表明SYNV完整病毒粒子可以通過植物木質(zhì)部導(dǎo)管進(jìn)行長(zhǎng)距離運(yùn)輸。超侵染排阻是指初侵染病毒阻止相同的或?qū)⒔牟《緦?duì)該細(xì)胞的再次侵染,是一種病毒之間的同源干擾(homologous interference),也被稱為交叉保護(hù)(cross protection)。利用不同熒光標(biāo)記的SYNV變體,發(fā)現(xiàn)SYNV在細(xì)胞水平和器官水平都存在明顯的SIE現(xiàn)象,而與親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的PVX之間并沒有SIE現(xiàn)象。瞬時(shí)表達(dá)SYNV M蛋白抑制SYNV侵染,而表達(dá)M mRNA則無抑制作用,表明SIE發(fā)生在M蛋白水平而不是RNA水平。相應(yīng)地,SYNVM缺失突變體部分喪失了對(duì)同源病毒排阻的能力。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),SYNV M蛋白可以通過與N蛋白的互作抑制基因組復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。MG126L突變體喪失了與SYNV N蛋白互作的能力后喪失了對(duì)SYNV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的抑制能力;同時(shí)M蛋白的NLS突變體無法與N蛋白在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生強(qiáng)烈互作,也喪失了對(duì)SYNV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的抑制能力。這些結(jié)果表明,初次侵染的SYNV經(jīng)復(fù)制后期大量表達(dá)的M蛋白通過與包裹基因組RNA的N蛋白互作,抑制病毒的基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,從而導(dǎo)致再次進(jìn)入細(xì)胞的同源病毒無法復(fù)制和侵染。本文利用SYNV反向遺傳學(xué)體系,深入研究了 SYNV的運(yùn)動(dòng)蛋白sc4的性質(zhì)以及SYNV在胞內(nèi)、胞間和長(zhǎng)距離運(yùn)動(dòng)上的特性;發(fā)現(xiàn)了 SYNV存在的SIE現(xiàn)象,并揭示了 SYNV誘發(fā)SIE現(xiàn)象的背后機(jī)制。本論文研究結(jié)果有助于深入理解植物負(fù)鏈RNA病毒運(yùn)動(dòng)和侵染等分子機(jī)制,為該類病毒病害的防控提供理論支撐。
【圖文】：

邐１緒論逡逑狀結(jié)構(gòu)，成熟的病毒粒子具有包膜，長(zhǎng)約２４８納米（ｎｍ），直徑約７０邋ｎｍ（圖１．１）。逡逑ＳＹＮＶ的最小侵染單元是它的核衣殼復(fù)合體（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄｓ，邋ＮＣｓ）邋（Ｗａｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．，逡逑２０１５）。ＮＣｓ結(jié)構(gòu)由病毒的ＲＮＡ鏈以及核心蛋白兩部分組成，其中核心蛋白分別逡逑是指邋ＲＮＡ邋聚合酶大亞基（ｌａｒｇｅ邋ｓｕｂｕｎｉｔ邋ｏｆ邋ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，邋Ｌ）、淲蛋白（ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ，逡逑Ｐ）和核衣殼蛋白（ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎ）邋（Ｈｅａｔｏｎ邋ｅｔａｌ．，邋１９８７，邋Ｗａｇｎｅｒ邋＆邋Ｊａｃｋｓｏｎ，邋１９９７）。逡逑在ＳＹＮＶ病毒粒子中，基質(zhì)蛋白（Ｍａｔｒｉｘ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，邋Ｍ）包圍著病毒核心ＮＣｓ結(jié)構(gòu)，逡逑在Ｍ蛋白外部是一層寄主來源的包膜結(jié)構(gòu)，包膜表面鑲嵌著病毒編碼的糖蛋白逡逑復(fù)合體（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ

ＳＹＮＶ作為細(xì)胞核彈狀病毒屬（Ｍ／ｃ／ｅｏｒ／？ａ６ｄｏｖ／ｍｓ）的成員，它的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制逡逑都在細(xì)胞核中進(jìn)行，這也是細(xì)胞核彈狀病毒與細(xì)胞質(zhì)彈狀病毒的最大區(qū)別。逡逑ＳＹＮＶ的轉(zhuǎn)錄遵循順序轉(zhuǎn)錄和極性轉(zhuǎn)錄兩個(gè)規(guī)則（圖１．３）。聚合酶復(fù)合體從病毒逡逑基因組的３’端起始轉(zhuǎn)錄，按照ｌｅａｄｅｒ－Ｎ－Ｐ－ｓｃ４－Ｍ－Ｇ－Ｌ的順序依次轉(zhuǎn)錄形成ｌｅａｄｅｒ逡逑ＲＮＡ和病毒各個(gè)基因的ｍＲＮＡ，稱之為順序轉(zhuǎn)錄（Ａｂｒａｈａｍ邋＆Ｂａｎｅｒｊｅｅ，邋１９７６）；逡逑而ｍＲＮＡ的產(chǎn)量依次遞減這一特點(diǎn)，稱之為極性轉(zhuǎn)錄。指導(dǎo)上下游基因轉(zhuǎn)錄終逡逑止和起始的順式作用元件保守地分布于各個(gè)基因之間，稱之為ＳＹＮＶ基因間隔逡逑區(qū)序列。該序列由三部分組成，分別是轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)“ＡＵＵＣＵＵＵＵＵ”、非轉(zhuǎn)錄逡逑雙核苷酸信號(hào)“ＧＧ”以及轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)“ＵＵＧ”。當(dāng)聚合酶復(fù)合體移動(dòng)到基因間逡逑隔區(qū)上游基因的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)時(shí)，上游基因的合成終止，，并在連續(xù)Ｕ的指導(dǎo)下，逡逑為產(chǎn)物ｍＲＮＡ的３’端被加上ｐｏｌｙ邋（Ａ）尾巴；聚合酶在基因間隔區(qū)上移動(dòng)至雙核逡逑苷酸信號(hào)“ＧＧ”時(shí)，約３０％聚合酶復(fù)合體從模版上解離，其余的聚合酶繼續(xù)向逡逑前移動(dòng)直到遇到下游基因轉(zhuǎn)錄的起始信號(hào)“ＵＵＧ”時(shí)起始下游基因的轉(zhuǎn)錄。有證逡逑據(jù)顯示
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S432.41

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8 許y斏

本文編號(hào)：2637042