【摘要】：植物病原線蟲引起的農(nóng)作物線蟲病害造成的損失已超過細(xì)菌病害、病毒病害造成的損失,成為僅次于真菌病害的第二大病害。在常見的植物寄生線蟲中,南方根結(jié)線蟲分布最為廣泛,引起的危害也最為嚴(yán)重,已成為世界農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的制約因素。由于南方根結(jié)線蟲的寄主廣泛性和內(nèi)寄生特性,目前依然缺乏高效、安全的防控方法。南方根結(jié)線蟲卵孵化后成為二齡幼蟲(second-stage juveniles,J2),在侵染植物前需要克服許多逆境,其中饑餓是最大的逆境之一。因此,從分子層面解析二齡幼蟲根外存活機(jī)制是建立高效防控措施的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。目前,對J2幼蟲如何度過饑餓的分子機(jī)制知之甚少。以前的研究發(fā)現(xiàn),根結(jié)線蟲二齡幼蟲在缺乏宿主植物的情況下,根外存活時(shí)長延伸,脂肪含量逐漸減少。但是,脂肪水解是否參與二齡幼蟲抵抗饑餓還不清楚�；谀戏礁Y(jié)線蟲基因組信息,本研究選取根外存活不同時(shí)期的三組(即Fresh,Middle和Last)二齡幼蟲分別進(jìn)行RNA-seq高通量測序,發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集到脂肪代謝和溶酶體途徑等相關(guān)代謝途徑。脂肪和溶酶體特異性染色及超微結(jié)構(gòu)分析,進(jìn)一步證實(shí)RNA-seq的分析結(jié)果。借助于RNA干擾技術(shù)和藥物抑制,本研究確定“花生四烯酸-溶酶體-脂肪”信號(hào)通路調(diào)控二齡幼蟲對饑脅迫的耐受,為南方根結(jié)線蟲防控措施的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1.RNA-seq測序分析結(jié)果顯示,短期饑餓脅迫誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因?yàn)?852個(gè),其中952個(gè)為上調(diào)差異表達(dá)基因;長期饑餓脅迫誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因?yàn)?930個(gè),其中862個(gè)為上調(diào)的差異表達(dá)基因,長、短期饑餓脅迫誘導(dǎo)的共有差異表達(dá)基因?yàn)?124個(gè)。差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析表明,上調(diào)的差異表達(dá)基因主要參與脂肪代謝、氨基酸分解、酮體的生成與分解和溶酶體等相關(guān)途徑;而下調(diào)的差異表達(dá)基因主要參與糖代謝和物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。富集到脂肪代謝的上調(diào)表達(dá)差異基因主要為脂酶基因(atgl-1),脂肪酸β氧化基因(acox-1),脂肪酸去飽和酶基因(fat-6,fat-3)以及參與脂代謝調(diào)控的hnf-4和ppar同源基因,而參與溶酶體途徑的主要是組織蛋白酶基因、糖苷酶基因和脂酶基因,說明二齡幼蟲根外存活期間,脂肪代謝和溶酶體生物發(fā)生顯著增強(qiáng)。2.饑餓脅迫促進(jìn)根結(jié)線蟲轉(zhuǎn)錄因子Mi-hlh-30表達(dá)上調(diào)。經(jīng)Mi-hlh-30_dsRNA處理后,Mi-lipl-1表達(dá)量降低。同時(shí),二齡幼蟲溶酶體的生物發(fā)生顯著受到抑制,根外存活時(shí)間明顯縮短,脂肪降解明顯受到抑制,二齡幼蟲的運(yùn)動(dòng)能力明顯降低,表明Mi-hlh-30調(diào)控溶酶體的生物發(fā)生和脂肪的水解。3.饑餓脅迫增加花生四烯酸的相對含量,參與花生四烯酸生成的脂肪酸去飽和酶基因Mi-fat-6和Mif-t-3分別被干擾后,Mi-hlh-30表達(dá)受到抑制,溶酶體產(chǎn)生顯著受到限制,根外存活的時(shí)間明顯縮短,脂肪水解減弱,運(yùn)動(dòng)能力顯著降低。添加下游產(chǎn)物花生四烯酸可恢復(fù)Mi-fat-6和Mi-fat-3分別沉默引起的表型缺陷,卻不能恢復(fù)Mi-hlh-30沉默引起的,進(jìn)一步說明Mifat-6和Mifat-3通過調(diào)節(jié)花生四烯酸的合成促進(jìn)Mi-hlh-30的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控溶酶體的生物發(fā)生。4.溶酶體特異性抑制劑(氯喹、氯化銨和Baf-Al)分別處理二齡幼蟲后,二齡幼蟲的表型缺陷與Mifat-6、Mifat-3和Mi-hlh-30分別被干擾后的類似,進(jìn)一步證實(shí)溶酶體介導(dǎo)的脂肪水解對二齡幼蟲根外存活的重要性。5.Mi-RAB7介導(dǎo)二齡幼蟲根外存活期間脂肪的水解,Mi-Rab7的沉默抑制脂肪水解和縮短根外存活時(shí)間。綜上所述:1.首次證實(shí)溶酶體參與二齡幼蟲根外存活期間脂肪的水解。2.證實(shí)饑餓脅迫促進(jìn)Mifat-6,Mi f-t-3的表達(dá),通過花生四烯酸的介導(dǎo),促進(jìn)Mi-hlh-30顯著表達(dá),進(jìn)而增強(qiáng)溶酶體產(chǎn)生,促進(jìn)脂肪降解。
【圖文】：

育較為成熟的卵和卵中的幼蟲其對根結(jié)線蟲卵粒的侵染主要包括附著、穿逡逑刺和定殖三個(gè)過程。首先，當(dāng)遇到根結(jié)線蟲卵粒時(shí)，厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)生大量逡逑的糖蛋白，以幫助分生孢子和菌絲粘住卵粒表面（圖１．２）邐其次，為穿過卵殼，逡逑厚垣孢普可尼亞菌的萌發(fā)管和菌絲頂端分化產(chǎn)生附著孢（圖１．３）邋１＂２１，并分泌胞外逡逑酶，然而，附著孢如何穿刺卵殼依然來知｜ｍ１。最后，為獲取營養(yǎng)并增加其繁殖能逡逑力，厚垣孢普可尼亞菌吸取卵中的糖類（二糖）作為碳源物質(zhì)。根結(jié)線蟲的卵殼逡逑主要由三層構(gòu)成（圖丨．４），即最外側(cè)富含各類蛋白的卵黃膜、中間層的幾丁質(zhì)層和逡逑內(nèi)側(cè)的脂質(zhì)層【｜｜４〗。厚垣孢普可尼亞菌能有效侵染根結(jié)線蟲的卵粒，許多胞外酶類逡逑物質(zhì)自然起到關(guān)鍵作用。Ｌｏｐｅｚ－Ｌｌｏｒｃａ等首先從厚垣孢普可尼亞菌中分離到并純化逡逑出絲氨酸蛋白酶Ｐ３２，其分子量為３２ｋＤａｌ｜ｌ５ｌ，隨后，Ｌｏｐｅｚ－Ｌｌｏｒｃａ等將純化后的絲逡逑l#酸蛋白酶Ｐ３２處理甜菜孢囊線蟲（Ｚ／ｅ／ｅｒａｉ／ｅｒａ．ｖｃ／ｗｃ／７／／７）卵粒，，與對照相比，絲逡逑氨酸蛋白酶Ｐ３２處理的卵粒

邐邐邋ＬＩＰＩＤ邋ＬＡＹＥＲ逡逑圖１．４：植物寄生線蟲卵殼截面示意圖。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．４：邋Ｄｉａｇｒａｍｍａｔｉｃ邋ｒｅｃｏｎｓｔｉ邋ｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａ邋ｃｒｏｓｓ邋ｓｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｅｇｇ邋ｓｈｅｌｌ邋ｏｆ逡逑ｐｌａｎｔ－ｐａｒａｓｉｔｉｃ邋ｎｅｍａｔｏｄｅｓ．逡逑圖片米源于：Ｂｉ丨？0！邋ａｎｄ邋Ｂｉｒｄ．邋７＞ｙ／／７似ｃ／／ｏ似邐（邋１９９１）逡逑淡紫色擬青霉（ＰＭＣ／７0ｍ＞Ｗ５邋／／／ａｃ／Ｍ．ｖ）是一種分布廣泛且常用來防控根結(jié)線逡逑蟲的兼性生防真菌，Ｌｙｓｅｋ等最初發(fā)現(xiàn)淡紫色擬青霉常與線蟲卵共生１１２５１，隨后，逡逑Ｊａｔａｌａ等在秘魯發(fā)現(xiàn)淡紫色擬以褐南方根結(jié)線蟲不是諱生關(guān)系，而是寄生于南方逡逑根結(jié)線蟲的卵粒１｜２？１２７】。與厚垣孢普可尼亞菌一樣，淡紫色擬青霉主要是植物寄生逡逑線蟲的卵，并且其對植物寄生蟲卵的侵染模式也主要包括三個(gè)過程，即附著、穿逡逑刺和定殖。同樣地，在淡紫色擬青霉侵染植物寄生線蟲卵的過程中，幾丁質(zhì)酶和逡逑絲氨酸蛋白酶也扮演著重要的作用［１２８］。在研宄花生根結(jié)線蟲的過程中，逡逑Ｍ邋0邋ｒｇａ邋ｎ邋－．丨0邋ｎ邋ｅ邋ｓ等將線蟲卵粒．１邋ｊ淡紫色■擬宵搏侵染共廔＃后，線蟲卵殼的超微結(jié)構(gòu)出逡逑現(xiàn)明顯的變化：卵黃層分裂成三個(gè)厚度不一的模塊
【學(xué)位授予單位】：云南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S432.45

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2622830