【摘要】：桑椹花青素是一種天然水溶性色素,其生物合成途徑涉及眾多結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的參與。植物miRNAs作為一類重要的調(diào)控因子,在花青素生物合成途徑中起著重要的調(diào)控作用。本研究以不同發(fā)育時(shí)期的桑椹為試驗(yàn)材料,利用基于Illumina高通量測(cè)序的小RNA數(shù)字化分析技術(shù),分析了不同發(fā)育時(shí)期桑椹中miRNAs表達(dá)譜的變化,鑒定出了參與桑椹花青素合成相關(guān)的miRNAs,并通過psRNATarget軟件預(yù)測(cè)了差異表達(dá)mi RNAs的靶基因;利用轉(zhuǎn)基因和qRT-PCR技術(shù)研究了mul-miR159a和mul-mi R477及其靶基因在花青素生物合成過程中的調(diào)控作用,為全面揭示桑椹花青素合成的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ),同時(shí)也為桑樹遺傳改良提供了候選基因,對(duì)于促進(jìn)桑樹功能基因組學(xué)研究具有重要意義。本文的主要研究結(jié)果如下:(1)不同發(fā)育時(shí)期桑椹中花青素的檢測(cè)通過pH示差法測(cè)定了不同發(fā)育時(shí)期桑椹總花色苷的含量,并采用HPLC技術(shù)對(duì)桑椹花青素進(jìn)行了定性與定量分析,結(jié)果表明:桑椹花青素主要有矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷兩種花色苷組成,桑椹由青轉(zhuǎn)紅變紫過程中,兩種花色苷含量逐漸升高。(2)桑椹小RNA高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建及測(cè)序分析構(gòu)建了不同發(fā)育時(shí)期的桑椹小RNA測(cè)序文庫(kù)并進(jìn)行了測(cè)序分析,在不同發(fā)育時(shí)期的桑椹中共鑒定了51個(gè)家族的139個(gè)保守的miRNAs,預(yù)測(cè)到42個(gè)新miRNAs,發(fā)現(xiàn)了76個(gè)差異表達(dá)miRNAs,并預(yù)測(cè)到124個(gè)靶基因,差異表達(dá)miRNAs的靶基因大多為調(diào)控植物次生代謝生物合成的轉(zhuǎn)錄因子。(3)mul-miR159a及其靶基因Mul-MYB33對(duì)花青素合成的調(diào)控作用分析利用PCR技術(shù)克隆獲得Mul-MIR159a基因及其靶基因Mul-MYB33,分別構(gòu)建了其植物表達(dá)載體,并侵染擬南芥獲得轉(zhuǎn)基因植株。熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)Mul-MIR159a在擬南芥中成功表達(dá),并能加工成mul-miR159a成熟體,生成的mul-miR159a可以靶向擬南芥中Mul-MYB33的同源基因Ath-MYB33,而Mul-MYB33基因在擬南芥中超表達(dá)使轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中花青素的積累量增加。因此,mul-miR159a可以通過靶向Mul-MYB33基因在花青素的生物合成過程中起到負(fù)調(diào)控作用。(4)Mul-MIR159a和Mul-MYB33基因啟動(dòng)子的克隆及其表達(dá)活性分析利用PCR技術(shù)分別克隆得到Mul-MIR159a基因啟動(dòng)子(pMulMIR159a)和Mul-MYB33基因啟動(dòng)子(pMulMYB33),并成功構(gòu)建了兩個(gè)啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體。通過PlantCARE在線軟件分析,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)啟動(dòng)子核苷酸序列中均含有TATA、CAAT-Box啟動(dòng)子核心元件,和光照、激素、低溫等響應(yīng)元件及MYB結(jié)合位點(diǎn),表明這兩個(gè)啟動(dòng)子可能具有復(fù)雜的誘導(dǎo)表達(dá)活性。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)侵染表達(dá)系統(tǒng),結(jié)合GUS組織化學(xué)染色證明了pMulMIR159a和pMulMYB33都具有光照和GA誘導(dǎo)表達(dá)活性;Mul-MIR159a和Mul-MYB33基因具有光照和GA誘導(dǎo)表達(dá)特性。(5)mul-miR477—MuL-ABCB19-AS—Mul-ABCB19級(jí)聯(lián)途徑對(duì)花青素合成的調(diào)控作用分析利用PCR技術(shù)克隆獲得Mul-MIR477、Mul-ABCB19-AS、Mul-ABCB19基因,分別構(gòu)建了其植物表達(dá)載體,并通過轉(zhuǎn)基因和雜交技術(shù)在擬南芥中建立了mul-miR477—Mul-ABCB19-AS—Mul-ABCB19級(jí)聯(lián)途徑。證明了mul-miR477對(duì)Mul-ABCB19-AS基因的靶向切割作用以及Mul-ABCB19-AS對(duì)Mul-ABCB19基因表達(dá)的抑制作用。發(fā)現(xiàn)Mul-ABCB19基因在擬南芥中表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因植株中花青素的積累量,而mul-miR477可以通過mul-miR477—Mul-ABCB19-AS—Mul-ABCB19級(jí)聯(lián)途徑正調(diào)控花青素的合成。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S888.2

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本文編號(hào)：2618100