【摘要】：桑椹花青素是一種天然水溶性色素,其生物合成途徑涉及眾多結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的參與。植物miRNAs作為一類重要的調(diào)控因子,在花青素生物合成途徑中起著重要的調(diào)控作用。本研究以不同發(fā)育時期的桑椹為試驗材料,利用基于Illumina高通量測序的小RNA數(shù)字化分析技術(shù),分析了不同發(fā)育時期桑椹中miRNAs表達譜的變化,鑒定出了參與桑椹花青素合成相關(guān)的miRNAs,并通過psRNATarget軟件預(yù)測了差異表達mi RNAs的靶基因;利用轉(zhuǎn)基因和qRT-PCR技術(shù)研究了mul-miR159a和mul-mi R477及其靶基因在花青素生物合成過程中的調(diào)控作用,為全面揭示桑椹花青素合成的分子機制奠定了基礎(chǔ),同時也為桑樹遺傳改良提供了候選基因,對于促進桑樹功能基因組學(xué)研究具有重要意義。本文的主要研究結(jié)果如下:(1)不同發(fā)育時期桑椹中花青素的檢測通過pH示差法測定了不同發(fā)育時期桑椹總花色苷的含量,并采用HPLC技術(shù)對桑椹花青素進行了定性與定量分析,結(jié)果表明:桑椹花青素主要有矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷兩種花色苷組成,桑椹由青轉(zhuǎn)紅變紫過程中,兩種花色苷含量逐漸升高。(2)桑椹小RNA高通量測序文庫的構(gòu)建及測序分析構(gòu)建了不同發(fā)育時期的桑椹小RNA測序文庫并進行了測序分析,在不同發(fā)育時期的桑椹中共鑒定了51個家族的139個保守的miRNAs,預(yù)測到42個新miRNAs,發(fā)現(xiàn)了76個差異表達miRNAs,并預(yù)測到124個靶基因,差異表達miRNAs的靶基因大多為調(diào)控植物次生代謝生物合成的轉(zhuǎn)錄因子。(3)mul-miR159a及其靶基因Mul-MYB33對花青素合成的調(diào)控作用分析利用PCR技術(shù)克隆獲得Mul-MIR159a基因及其靶基因Mul-MYB33,分別構(gòu)建了其植物表達載體,并侵染擬南芥獲得轉(zhuǎn)基因植株。熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)Mul-MIR159a在擬南芥中成功表達,并能加工成mul-miR159a成熟體,生成的mul-miR159a可以靶向擬南芥中Mul-MYB33的同源基因Ath-MYB33,而Mul-MYB33基因在擬南芥中超表達使轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中花青素的積累量增加。因此,mul-miR159a可以通過靶向Mul-MYB33基因在花青素的生物合成過程中起到負調(diào)控作用。(4)Mul-MIR159a和Mul-MYB33基因啟動子的克隆及其表達活性分析利用PCR技術(shù)分別克隆得到Mul-MIR159a基因啟動子(pMulMIR159a)和Mul-MYB33基因啟動子(pMulMYB33),并成功構(gòu)建了兩個啟動子的植物表達載體。通過PlantCARE在線軟件分析,發(fā)現(xiàn)兩個啟動子核苷酸序列中均含有TATA、CAAT-Box啟動子核心元件,和光照、激素、低溫等響應(yīng)元件及MYB結(jié)合位點,表明這兩個啟動子可能具有復(fù)雜的誘導(dǎo)表達活性。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時侵染表達系統(tǒng),結(jié)合GUS組織化學(xué)染色證明了pMulMIR159a和pMulMYB33都具有光照和GA誘導(dǎo)表達活性;Mul-MIR159a和Mul-MYB33基因具有光照和GA誘導(dǎo)表達特性。(5)mul-miR477—MuL-ABCB19-AS—Mul-ABCB19級聯(lián)途徑對花青素合成的調(diào)控作用分析利用PCR技術(shù)克隆獲得Mul-MIR477、Mul-ABCB19-AS、Mul-ABCB19基因,分別構(gòu)建了其植物表達載體,并通過轉(zhuǎn)基因和雜交技術(shù)在擬南芥中建立了mul-miR477—Mul-ABCB19-AS—Mul-ABCB19級聯(lián)途徑。證明了mul-miR477對Mul-ABCB19-AS基因的靶向切割作用以及Mul-ABCB19-AS對Mul-ABCB19基因表達的抑制作用。發(fā)現(xiàn)Mul-ABCB19基因在擬南芥中表達可以提高轉(zhuǎn)基因植株中花青素的積累量,而mul-miR477可以通過mul-miR477—Mul-ABCB19-AS—Mul-ABCB19級聯(lián)途徑正調(diào)控花青素的合成。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S888.2

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本文編號：2618100