本文關(guān)鍵詞：尿液exosome分離方法研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的比較3種方法即超速離心法、超濾法和沉淀法對(duì)人尿液來(lái)源exosome分離結(jié)果的影響,并進(jìn)一步探究exosome的最佳分離條件。本研究為臨床上選擇合適的人尿液exosome分離方法提供了參考依據(jù)。方法1.采用超速離心法、超濾法及沉淀法分別從20個(gè)健康人和10個(gè)慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)患者尿液中分離提取exosome;用透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察exosome大小形狀,蛋白質(zhì)印跡法(Western-blot)檢測(cè)exosome標(biāo)志蛋白TSG101及Alix以鑒定exosome。2.在尿量及exosome總蛋白量相同情況下,用Western-blot檢測(cè)3種方法分離提取的尿exosome中標(biāo)志蛋白,比較不同分離方法分離尿exosome的效果。3.Western-blot檢測(cè)尿exosome中標(biāo)志蛋白以分析尿液樣本17,000g離心前是否有必要低速離心去除細(xì)胞以及不同離心力(100,000g,150,000g,200,000g及250,000g)、離心時(shí)間(0.5h,1h及2h)及溫度(4℃,25℃及37℃)對(duì)超速離心分離尿液exosome結(jié)果的影響。結(jié)果1.在透射電鏡下,3種方法分離的exosome都呈圓形或橢圓形囊泡樣結(jié)構(gòu),直徑40-100nm、包膜完整,腔內(nèi)為均一的低電子密度物質(zhì)。Western-blot法檢測(cè)exsome標(biāo)志蛋白TSG101和Alix,結(jié)果顯示,超速離心法及超濾法可以檢測(cè)到exosome標(biāo)志物TSG101、Alix,而超速離心法上清、超濾法濾液、沉淀法沉淀和上清都未能檢測(cè)到。2.在尿量相同情況下,3種分離方法獲得exosome分別進(jìn)行蛋白標(biāo)志物TSG101及Alix檢測(cè),Western-blot結(jié)果顯示超速離心法印跡條帶灰度最深,且所有樣本均能檢測(cè)出TSG101及Alix蛋白;超濾法獲取的exosome,健康人尿液來(lái)源的exosome均能檢測(cè)出TSG101及Alix蛋白,但在CKD患者均未能檢測(cè)到;而沉淀法在所有樣本均未檢測(cè)到exosome標(biāo)志蛋白。調(diào)整上樣體積使得exosome總蛋白量Western-blot檢測(cè)3種分離方法得到的exosome中的標(biāo)志蛋白,結(jié)果顯示超速離心法分離得到的exosome量最多且在所有樣本均能檢測(cè)到TSG101及Alix蛋白表達(dá);超濾法在20個(gè)健康人中有11個(gè)人能檢測(cè)到TSG101及Alix,10個(gè)CKD患者未能檢測(cè)到;而沉淀法在所有樣本均未檢測(cè)到exosome志蛋白。3.Western-blot結(jié)果表明,低速離心去除細(xì)胞的尿樣本及未低速離心去除細(xì)胞的尿樣本,分離獲得的exosome印跡條帶灰度無(wú)明顯差異;超速離心法分離尿液exosome,隨著離心力及離心時(shí)間的增加,印跡條帶灰度逐漸加深,250,000g,2h離心條件下分離獲得的exosome印跡條帶灰度最深,而不同溫度條件下,印跡條帶灰度無(wú)明顯差異。結(jié)論較超濾法及沉淀法,超速離心法分離尿液exosome的效率最高,是值得推薦的尿液exosome分離方法。尿液樣本17,000g離心前無(wú)需低速離心去細(xì)胞,超速離心法分離尿液exosome效果在離心力為250,000g及離心時(shí)間為2h時(shí)分離效果最好,而離心溫度對(duì)exosome分離無(wú)明顯影響。
【關(guān)鍵詞】：超速離心法 超濾法 沉淀法 尿 exosome分離
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R446.12
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-15
• 注釋表15-17
• 第一章 緒論17-23
• 1.1 exosome17-18
• 1.1.1 exosome概述17
• 1.1.2 exosome的生理病理學(xué)功能17-18
• 1.1.3 exosome的臨床應(yīng)用18
• 1.2 尿液來(lái)源exosome18-22
• 1.2.1 尿液exosome概述18-19
• 1.2.2 尿樣本收集、存儲(chǔ)及分離前處理19-20
• 1.2.3 尿液exosome分離純化20-22
• 1.3 小結(jié)22-23
• 第二章 研究目的、方法、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和意義23-25
• 2.1 研究目的23
• 2.2 研究方法23-24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案24
• 2.4 研究意義24-25
• 第三章 尿液exosome分離鑒定25-31
• 3.1 材料與儀器25-26
• 3.1.1 主要材料25
• 3.1.2 主要儀器25-26
• 3.2 方法26-27
• 3.2.1 人尿液樣本收集及前處理26
• 3.2.2 尿液exosome的分離26-27
• 3.2.3 透射電鏡觀察尿液exosome的形態(tài)27
• 3.2.4 BCA法檢測(cè)尿液exosome總蛋白濃度27
• 3.2.5 Western-blot檢測(cè)尿液exosome的標(biāo)志蛋白27
• 3.3 結(jié)果27-29
• 3.3.1 尿液exosome的形態(tài)特征27-28
• 3.3.2 尿液exosome總蛋白濃度檢測(cè)28
• 3.3.3 尿液exosome標(biāo)志蛋白檢測(cè)28-29
• 3.4 討論29-31
• 第四章 尿液exosome 3 種分離方法比較31-40
• 4.1 材料與儀器31-32
• 4.1.1 主要材料31-32
• 4.1.2 主要儀器32
• 4.2 方法32-34
• 4.2.1 人尿液樣本收集及前處理32
• 4.2.2 超速離心法分離尿液exosome32-33
• 4.2.3 超濾法分離尿液exosome33
• 4.2.4 沉淀法分離尿液exosome33
• 4.2.5 BCA法檢測(cè)尿液exosome總蛋白濃度33
• 4.2.6 尿量或exosome總蛋白量相同情況下Western-blot檢測(cè)尿液exosome的標(biāo)志蛋白33-34
• 4.3 結(jié)果34-38
• 4.3.1 相同體積尿樣本條件下3種不同分離方法的比較34-36
• 4.3.2 相同exosome總蛋白量條件下3種不同分離方法的比較36-38
• 4.4 討論38-40
• 第五章 超速離心法分離尿液exosome方法優(yōu)化40-49
• 5.1 材料與儀器40-41
• 5.1.1 主要材料40
• 5.1.2 主要儀器40-41
• 5.2 方法41-42
• 5.2.1 人尿液樣本收集及前處理41
• 5.2.2 超速離心法分離尿液exosome41-42
• 5.2.3 Western-blot檢測(cè)尿液exosome的標(biāo)志蛋白42
• 5.3 結(jié)果42-48
• 5.3.1 低速離心去細(xì)胞對(duì)尿液exosome分離的影響42-44
• 5.3.2 超速離心法分離尿液exosome的適宜條件探究44-48
• 5.4 討論48-49
• 第六章 結(jié)論與展望49-50
• 一、結(jié)論49
• 二、展望49-50
• 參考文獻(xiàn)50-55
• 尿液exosome的分離方法及在臨床中應(yīng)用研究進(jìn)展(綜述)55-67
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 致謝67-68
• 攻讀碩士學(xué)位 期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文68

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王東關(guān);孫善珍;王振光;王霞;;腫瘤exosome誘導(dǎo)特異性T殺傷細(xì)胞的研究[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;2006年02期

2 王東關(guān);孫善珍;王振光;施琳;王霞;;腫瘤exosome誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的特異性殺傷作用[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2006年02期

3 張?jiān)谠?李希德;劉葉;王志侖;潘祥林;;肺癌細(xì)胞裂解物負(fù)載對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞分泌的exosome誘導(dǎo)抗腫瘤作用的影響[J];山東醫(yī)藥;2011年31期

4 薩仁高娃;吳巖;肖文華;;exosome與腫瘤免疫治療的研究進(jìn)展[J];感染.炎癥.修復(fù);2008年03期

5 金錚;于金錄;楊Pr;李超;黃海燕;;膠質(zhì)瘤來(lái)源exosome的鑒定及其蛋白質(zhì)組成研究[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué);2010年09期

6 杜嘉瑞;張路遙;楊洪發(fā);別黎;徐惠勇;陳立兵;鞠硯;;膠質(zhì)瘤細(xì)胞來(lái)源exosome的鑒定及其蛋白組成研究[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué);2008年01期

7 張堯;張家摸;何百成;羅春麗;吳小候;;腎癌細(xì)胞來(lái)源exosome的制備和免疫相關(guān)蛋白組成的初步研究[J];重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2010年01期

8 元小寧;朱運(yùn)峰;;外泌體(Exosome)及其在腫瘤調(diào)控中的作用[J];中國(guó)生物工程雜志;2013年08期

9 沈宜;向自武;陳國(guó)慶;謝瑩珊;鄭維萍;;As_2O_3聯(lián)合H_(22)源exosome的抗腫瘤作用研究[J];激光雜志;2009年04期

10 耿建;金潔;陳龍邦;;以exosome為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2006年09期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 秦霞;邱峰;;近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于exosome研究的文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)分析[A];2010年中國(guó)藥學(xué)大會(huì)暨第十屆中國(guó)藥師周論文集[C];2010年

2 張琳;鄭桂娜;萬(wàn)宇峰;郭一鳴;魏盼盼;郭金虎;;exosome復(fù)合物對(duì)生物鐘基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控研究[A];中國(guó)的遺傳學(xué)研究——遺傳學(xué)進(jìn)步推動(dòng)中國(guó)西部經(jīng)濟(jì)與社會(huì)發(fā)展——2011年中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)大會(huì)論文摘要匯編[C];2011年

3 顧麗亞;惠杰;;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞exosome對(duì)自身心肌分化及抗凋亡實(shí)驗(yàn)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十五次全國(guó)心血管病學(xué)大會(huì)論文匯編[C];2013年

4 孫禎;宋亞軍;黃赤兵;;大鼠腸系膜淋巴結(jié)和外周淋巴結(jié)固有exosome的制備[A];2013中國(guó)器官移植大會(huì)論文匯編[C];2013年

5 徐保鋒;黃海燕;關(guān)毅;吳宣萱;;膠質(zhì)瘤源性exosome的研究進(jìn)展[A];2011中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)外科學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

6 Hong-Wei Wang;;Alternative pathways of RNA recruitment in yeast exosome revealed by single particle electron microscopy[A];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)第十一次會(huì)員代表大會(huì)暨2014年全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集——專題報(bào)告一[C];2014年

7 ;Characterations and functions of exosome[A];2012全國(guó)臨床微生物與感染免疫學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2012年

8 孫禎;黃赤兵;;各淋巴組織源性exosome的收集方法比較的研究[A];2012中國(guó)器官移植大會(huì)論文匯編[C];2012年

9 宋亞軍;黃赤兵;;探討小鼠腸系膜淋巴結(jié)exosome對(duì)外周血T細(xì)胞增殖的影響[A];2013中國(guó)器官移植大會(huì)論文匯編[C];2013年

10 卜寧;孫秉中;李奇靈;于華;;K562細(xì)胞分泌的exosome電鏡標(biāo)本的制備及觀察[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第八次全國(guó)血液學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王汝霖;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源exosome對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

2 呂林懋;心肌成纖維細(xì)胞來(lái)源的exosome在血管緊張素-2誘導(dǎo)的心肌肥大中的作用及機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2015年

3 胡藝冰;腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌exosome增強(qiáng)腫瘤干細(xì)胞化療耐藥性研究[D];華中科技大學(xué);2015年

4 卜寧;慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞分泌的exosome的抗白血病作用研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2006年

5 王東關(guān);負(fù)載exosome的樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)抗舌鱗癌效應(yīng)的研究[D];山東大學(xué);2006年

6 彭澎;卵巢癌患者腹水來(lái)源exosome對(duì)機(jī)體抗卵巢癌免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究及其蛋白質(zhì)組成分析[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2007年

7 吳塵軒;增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞及其相關(guān)exosome抗肝癌免疫效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2008年

8 黃海燕;膠質(zhì)瘤及膠質(zhì)瘤細(xì)胞株源exosome的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];吉林大學(xué);2008年

9 余雪松;口服RDP58肽誘導(dǎo)的Treg源性exosomes抑制大鼠腎移植排斥的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2012年

10 郭軍;熱休克腫瘤細(xì)胞上清及EXOSOME中趨化因子的發(fā)現(xiàn)及一種非細(xì)胞結(jié)構(gòu)性新型高效腫瘤疫苗的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2002年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 周葉;冠心病人血清外泌體miRNA表達(dá)譜分析[D];中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2015年

2 劉振方;CD151在直腸癌組織及尿液exosome小體中表達(dá)的對(duì)比研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

3 王碩;外周血exosome中miRNA在肝癌中的臨床意義[D];中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2015年

4 呂浩;不同預(yù)處理方法對(duì)MSCs分泌的exosomes免疫調(diào)節(jié)功能影響的研究[D];蘇州大學(xué);2015年

5 廖克曼;miR-150*通過(guò)修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的exosome影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖凋亡的相關(guān)研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2015年

6 楊燕;X-射線照射后A549細(xì)胞釋放的exosome對(duì)同源細(xì)胞及巨噬細(xì)胞功能的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

7 朱迎星;尿液exosome分離方法研究[D];江蘇大學(xué);2016年

8 張路遙;膠質(zhì)瘤源性exosome分離和提純的實(shí)驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2007年

9 孫禎;腸系膜淋巴結(jié)固有exosome的制備及其對(duì)異體淋巴細(xì)胞增殖的影響[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

10 杜嘉瑞;膠質(zhì)瘤來(lái)源exosome的鑒定及其蛋白組成研究[D];吉林大學(xué);2007年

  本文關(guān)鍵詞：尿液exosome分離方法研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：333007