本文關(guān)鍵詞：尿液exosome分離方法研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的比較3種方法即超速離心法、超濾法和沉淀法對人尿液來源exosome分離結(jié)果的影響,并進(jìn)一步探究exosome的最佳分離條件。本研究為臨床上選擇合適的人尿液exosome分離方法提供了參考依據(jù)。方法1.采用超速離心法、超濾法及沉淀法分別從20個健康人和10個慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)患者尿液中分離提取exosome;用透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察exosome大小形狀,蛋白質(zhì)印跡法(Western-blot)檢測exosome標(biāo)志蛋白TSG101及Alix以鑒定exosome。2.在尿量及exosome總蛋白量相同情況下,用Western-blot檢測3種方法分離提取的尿exosome中標(biāo)志蛋白,比較不同分離方法分離尿exosome的效果。3.Western-blot檢測尿exosome中標(biāo)志蛋白以分析尿液樣本17,000g離心前是否有必要低速離心去除細(xì)胞以及不同離心力(100,000g,150,000g,200,000g及250,000g)、離心時間(0.5h,1h及2h)及溫度(4℃,25℃及37℃)對超速離心分離尿液exosome結(jié)果的影響。結(jié)果1.在透射電鏡下,3種方法分離的exosome都呈圓形或橢圓形囊泡樣結(jié)構(gòu),直徑40-100nm、包膜完整,腔內(nèi)為均一的低電子密度物質(zhì)。Western-blot法檢測exsome標(biāo)志蛋白TSG101和Alix,結(jié)果顯示,超速離心法及超濾法可以檢測到exosome標(biāo)志物TSG101、Alix,而超速離心法上清、超濾法濾液、沉淀法沉淀和上清都未能檢測到。2.在尿量相同情況下,3種分離方法獲得exosome分別進(jìn)行蛋白標(biāo)志物TSG101及Alix檢測,Western-blot結(jié)果顯示超速離心法印跡條帶灰度最深,且所有樣本均能檢測出TSG101及Alix蛋白;超濾法獲取的exosome,健康人尿液來源的exosome均能檢測出TSG101及Alix蛋白,但在CKD患者均未能檢測到;而沉淀法在所有樣本均未檢測到exosome標(biāo)志蛋白。調(diào)整上樣體積使得exosome總蛋白量Western-blot檢測3種分離方法得到的exosome中的標(biāo)志蛋白,結(jié)果顯示超速離心法分離得到的exosome量最多且在所有樣本均能檢測到TSG101及Alix蛋白表達(dá);超濾法在20個健康人中有11個人能檢測到TSG101及Alix,10個CKD患者未能檢測到;而沉淀法在所有樣本均未檢測到exosome志蛋白。3.Western-blot結(jié)果表明,低速離心去除細(xì)胞的尿樣本及未低速離心去除細(xì)胞的尿樣本,分離獲得的exosome印跡條帶灰度無明顯差異;超速離心法分離尿液exosome,隨著離心力及離心時間的增加,印跡條帶灰度逐漸加深,250,000g,2h離心條件下分離獲得的exosome印跡條帶灰度最深,而不同溫度條件下,印跡條帶灰度無明顯差異。結(jié)論較超濾法及沉淀法,超速離心法分離尿液exosome的效率最高,是值得推薦的尿液exosome分離方法。尿液樣本17,000g離心前無需低速離心去細(xì)胞,超速離心法分離尿液exosome效果在離心力為250,000g及離心時間為2h時分離效果最好,而離心溫度對exosome分離無明顯影響。
【關(guān)鍵詞】：超速離心法 超濾法 沉淀法 尿 exosome分離
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R446.12
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-15
• 注釋表15-17
• 第一章 緒論17-23
• 1.1 exosome17-18
• 1.1.1 exosome概述17
• 1.1.2 exosome的生理病理學(xué)功能17-18
• 1.1.3 exosome的臨床應(yīng)用18
• 1.2 尿液來源exosome18-22
• 1.2.1 尿液exosome概述18-19
• 1.2.2 尿樣本收集、存儲及分離前處理19-20
• 1.2.3 尿液exosome分離純化20-22
• 1.3 小結(jié)22-23
• 第二章 研究目的、方法、實驗設(shè)計方案和意義23-25
• 2.1 研究目的23
• 2.2 研究方法23-24
• 2.3 實驗設(shè)計方案24
• 2.4 研究意義24-25
• 第三章 尿液exosome分離鑒定25-31
• 3.1 材料與儀器25-26
• 3.1.1 主要材料25
• 3.1.2 主要儀器25-26
• 3.2 方法26-27
• 3.2.1 人尿液樣本收集及前處理26
• 3.2.2 尿液exosome的分離26-27
• 3.2.3 透射電鏡觀察尿液exosome的形態(tài)27
• 3.2.4 BCA法檢測尿液exosome總蛋白濃度27
• 3.2.5 Western-blot檢測尿液exosome的標(biāo)志蛋白27
• 3.3 結(jié)果27-29
• 3.3.1 尿液exosome的形態(tài)特征27-28
• 3.3.2 尿液exosome總蛋白濃度檢測28
• 3.3.3 尿液exosome標(biāo)志蛋白檢測28-29
• 3.4 討論29-31
• 第四章 尿液exosome 3 種分離方法比較31-40
• 4.1 材料與儀器31-32
• 4.1.1 主要材料31-32
• 4.1.2 主要儀器32
• 4.2 方法32-34
• 4.2.1 人尿液樣本收集及前處理32
• 4.2.2 超速離心法分離尿液exosome32-33
• 4.2.3 超濾法分離尿液exosome33
• 4.2.4 沉淀法分離尿液exosome33
• 4.2.5 BCA法檢測尿液exosome總蛋白濃度33
• 4.2.6 尿量或exosome總蛋白量相同情況下Western-blot檢測尿液exosome的標(biāo)志蛋白33-34
• 4.3 結(jié)果34-38
• 4.3.1 相同體積尿樣本條件下3種不同分離方法的比較34-36
• 4.3.2 相同exosome總蛋白量條件下3種不同分離方法的比較36-38
• 4.4 討論38-40
• 第五章 超速離心法分離尿液exosome方法優(yōu)化40-49
• 5.1 材料與儀器40-41
• 5.1.1 主要材料40
• 5.1.2 主要儀器40-41
• 5.2 方法41-42
• 5.2.1 人尿液樣本收集及前處理41
• 5.2.2 超速離心法分離尿液exosome41-42
• 5.2.3 Western-blot檢測尿液exosome的標(biāo)志蛋白42
• 5.3 結(jié)果42-48
• 5.3.1 低速離心去細(xì)胞對尿液exosome分離的影響42-44
• 5.3.2 超速離心法分離尿液exosome的適宜條件探究44-48
• 5.4 討論48-49
• 第六章 結(jié)論與展望49-50
• 一、結(jié)論49
• 二、展望49-50
• 參考文獻(xiàn)50-55
• 尿液exosome的分離方法及在臨床中應(yīng)用研究進(jìn)展(綜述)55-67
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 致謝67-68
• 攻讀碩士學(xué)位 期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文68

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本文編號：333007