本文關鍵詞：四種高致病性病毒候選診斷抗原的制備及鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:蜱傳腦炎病毒(Tick-borne Encephalitis Virus,TBEV)、基孔肯雅病毒(Chikungunya Virus,CHIKV)、黃熱病毒(Yellow Fever Virus,YFV)與埃博拉(Ebola Virus)病毒均是高致病性烈性病毒,對于這些病毒的實驗研究需要在高等級的生物安全實驗室中進行,增加了實驗的成本和難度。為了能夠降低實驗感染風險,能在低等級生物安全實驗室完成相關病毒的檢測與鑒定,本實驗根據(jù)4種高致病性病毒的分子結構特點,分別選取了適合用作診斷抗原的基因,用不同的表達系統(tǒng)表達抗原,為這4種高致病性烈性病毒的血清學特異性診斷提供了候選抗原。方法:1.將TBEV的pr M-E基因連接到p NLF1-sec N質粒中構建真核表達載體p NLF-pr M-E,并將重組質粒轉染到COS7細胞中,與Nano Glo Luciferase熒光素酶蛋白進行融合表達,并通過測定細胞上清液的熒光素酶值鑒定蛋白的表達情況;間接免疫熒光試驗鑒定重組蛋白與TBEV特異性抗體的結合情況;熒光素酶免疫共沉淀(Luciferase Immunoprecipitation System,LIPS)方法對20份TBEV病人陽性血清及3份正常人血清進行檢測。2.通過原核表達的方法將CHIKV的E1、E2基因,YFV的E基因和Ebola V的NP基因重組表達,并通過鎳柱親和純化重組蛋白;將CHIKV的重組蛋白作為檢測抗原,通過ELISA方法對基孔恢復期病人感染血清中的特異性抗體進行檢測;以YFV的重組蛋白作為檢測抗原對實驗室已制備的YFV免疫鼠血清中的特異性抗體進行檢測;將Ebola V的重組蛋白NP作為免疫原免疫小鼠,并以NP蛋白作為檢測抗原對免疫小鼠血清中的特異性抗體進行檢測。結果:1.轉染重組質粒p NLF-pr M-E的細胞上清中可檢測到熒光素酶的高表達;間接免疫熒光試驗檢測到用p NLF-pr M-E重組質粒轉染的細胞與TBEV抗體特異結合;LIPS方法以重組蛋白pr M-E為檢測抗原從20份TBEV患者血清中檢測出19份陽性結果,3份正常人血清均為陰性。2.成功表達并純化出CHIKV的CHIKV E1-1、CHIKVE2-1與CHIKV E2-2重組蛋白,YFV的YFV E1-1、YFV E1-2與YFV E2-1重組蛋白,以及Ebalo V的NP重組蛋白;未能成功表達CHIKV E1-2與YFV E2-2重組蛋白;CHIKV E1-1、CHIKV E2-1與CHIKV E2-2三種重組抗原作均能與基孔恢復期病人感染血清特異性結合,并與同屬病毒免疫的對照血清無交叉反應;YFV E1-1、YFV E1-2、YFV E2-1三種重組抗原均能與YF免疫鼠血清中的抗體良好結合,雖與DEN3型患者血清有一定的交叉反應,但與陽性鼠血清相比可以辨別區(qū)分;成功制備了Ebola V免疫小鼠血清,血清中的抗體能與重組抗原NP特異結合,并與其它對照血清無交叉反應。結論:1.成功構建了真核表達載體p NLF-pr M-E,并在COS7細胞中進行了表達pr M-E蛋白具有良好的抗原性,可作為TBEV感染的檢測抗原。2成功構建了CHIKV E1-1、CHIKV E2-1、CHIKV E2-2、YFV E1-1、YFV E1-2、YF E2-2與NP的重組表達質粒,均能在原核細胞中正確誘導表達蛋白;CHIKV E1-1、CHIKV E2-1、CHIKV E2-2、YFV E1-1、YFV E1-2、YFV E2-2與NP重組抗原均有良好的抗原性,有望作為CHIKV、YFV和Ebola V檢測的候選診斷抗原。
【關鍵詞】：烈性病毒 抗原 診斷 真核表達 原核表達
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R446.6
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-17
• 1 病毒簡介10-12
• 2 病毒感染的診斷方法12-14
• 3 抗原表達系統(tǒng)的類型14-16
• 5 研究內容與意義16-17
• 第一部分 蜱傳腦炎病毒Pr M-E抗原在真核系統(tǒng)中的表達及鑒定17-33
• 引言17-18
• 1 材料18-20
• 1.1 病毒及血清18
• 1.2 試劑與耗材18-19
• 1.3 常規(guī)溶液配制19-20
• 1.4 主要儀器20
• 2 方法20-28
• 2.1 重組質粒的構建20-26
• 2.2 真核蛋白的表達26-27
• 2.3 真核蛋白的鑒定27-28
• 3 實驗結果28-31
• 4 討論31-32
• 5 結論32-33
• 第二部分 三種高致病性病毒重組抗原的原核表達及鑒定33-62
• 1 引言33-35
• 2 材料35-38
• 2.1 病毒及血清35
• 2.2 試劑與耗材35-36
• 2.3 常規(guī)溶液配制36-38
• 2.4 主要儀器38
• 3 方法38-50
• 3.1 原核表達重組質粒的構建38-47
• 3.2 構建原核表達菌株47
• 3.3 重組蛋白的表達47-48
• 3.4 融合蛋白的純化48
• 3.5 埃博拉病毒抗 NP 蛋白鼠血清的制備48-49
• 3.6 間接免疫熒光實驗49
• 3.7 ELISA抗原結合特異性實驗49-50
• 4 實驗結果50-58
• 5 實驗討論58-61
• 6 結論61-62
• 綜述62-66
• 參考文獻66-73
• 個人簡歷73-74
• 致謝74

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1 王均珠　實習生 常青;查出烈性病毒 只需一天[N];貴陽日報;2007年

2 記者　 陳勇 通訊員　 蔣明 楚靜 實習生 王玨;楊占秋扼住烈性病毒咽喉[N];湖北日報;2006年

3 陳健雄;警惕豬亞健康綜合征[N];河北科技報;2007年

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1 冉鑫;四種高致病性病毒候選診斷抗原的制備及鑒定[D];安徽醫(yī)科大學;2016年

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本文編號：317524