本文關(guān)鍵詞：膀胱癌特異性的嵌合型溶瘤腺病毒構(gòu)建及其療效初步評價，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的對于惡性度高的膀胱癌細(xì)胞,其表面的柯薩奇-腺病毒受體(coxsackie adenovirus receptor,CAR)表達(dá)極低,5型腺病毒有限的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率難以發(fā)揮溶瘤效果。我們課題組通過基因改造變換病毒的親嗜性,即選用11型腺病毒纖毛結(jié)合5型腺病毒骨架,并將膀胱組織特異性啟動子尿路空斑蛋白2(uroplakin II,UPII)和前列腺干細(xì)胞抗原增強(qiáng)子(prostate stem cell antigen enhancer,PSCAE)的基序插入病毒復(fù)制早期基因E1A前,構(gòu)建具有膀胱癌選擇性的不依賴于CAR的嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11-PSCAE-UPII-E1A。觀察嵌合型腺病毒對EJ和T24兩種膀胱癌細(xì)胞株的形態(tài)、增殖能力的影響,探求病毒的最適感染劑量,進(jìn)一步對比觀察嵌合型腺病毒Ad/F11-PSCAE-UPII-E1A和5型腺病毒Ad5-PSCAE-UPII-E1A對EJ和T24細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和溶瘤能力的差異,為膀胱癌基因治療提供新的選擇和實驗依據(jù)。方法將嵌合11型纖毛的5型腺病毒骨架Ad5/F11,與本室保存的穿梭質(zhì)粒Rp-PSACE-UPII-E1A,在大腸桿菌BJ5183內(nèi)將同源區(qū)段替換重組。在卡那霉素抗性條件下,篩選出陽性單克隆重組子菌落,抽提質(zhì)粒后PCR擴(kuò)增UPII、PSCAE和E1A基因,并用PacI和BsrGI酶切質(zhì)粒,電泳檢測產(chǎn)物大小。挑取鑒定完全正確的重組腺病毒質(zhì)粒,純化后設(shè)不同比例轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,觀察病毒包裝結(jié)果。提取第一代腺病毒基因組,經(jīng)PCR檢測各目的基因的正確性,然后以第一代病毒感染HEK293細(xì)胞大量擴(kuò)增,純化病毒后采用TCID50法測定滴度。常規(guī)培養(yǎng)EJ和T24細(xì)胞,以HEK293為標(biāo)準(zhǔn),RT-PCR檢測兩種細(xì)胞表面CD46的相對表達(dá)量。CCK8測定嵌合型腺病毒Ad5/F11-PSCAE-UPII-E1A在不同梯度的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)下,對EJ細(xì)胞和T24細(xì)胞的溶瘤能力,取病毒感染最佳MOI,與5型腺病毒Ad5-PSCAE-UPII-E1A作比較,病毒干預(yù)8d后,測定EJ和T24兩種細(xì)胞的活力變化。結(jié)果腺病毒Ad5/F11-PSCAE-UPII-E1A構(gòu)建成功,滴度為1×1010PFU/ml。RT-PCR數(shù)據(jù)顯示EJ和T24細(xì)胞的CD46表達(dá)明顯高于HEK293細(xì)胞。CCK8測定結(jié)果表明,以20~40 MOI病毒量干預(yù)EJ和T24細(xì)胞后,細(xì)胞存活率的下降速度最快。與Ad5-PSCAE-UPII-E1A相比,Ad5/F11-PSCAE-UPII-E1A對EJ和T24細(xì)胞的溶瘤作用較為顯著。感染8d后,Ad5/F11-PSCAE-UPII-E1A病毒干預(yù)組EJ和T24細(xì)胞的存活率分別為19.6±3.48%和51.8±2.48%;Ad5-PSCAE-UPII-E1A病毒干預(yù)組EJ和T24細(xì)胞的存活率分別為33.38±2.54%和80.27±2.18%。結(jié)論膀胱選擇性的高滴度腺病毒Ad5/F11-PSCAE-UPII-E1A構(gòu)建成功,能高效殺傷T24和EJ細(xì)胞,溶瘤能力優(yōu)于腺病毒Ad5-PSCAE-UPII-E1A,這與病毒識別受體的改變有關(guān),提示增加病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率可直接強(qiáng)化病毒溶瘤效果,這為膀胱癌治療的選擇奠定初步的實驗基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：膀胱癌 基因治療 尿路空斑蛋白 前列腺干細(xì)胞抗原 溶瘤腺病毒 嵌合型
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.14;R450
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 縮略詞表7-10
• 一 前言10-16
• 二 材料與方法16-27
• 2.1 實驗材料與試劑16-17
• 2.1.1 質(zhì)粒、細(xì)菌菌株和細(xì)胞株16
• 2.1.2 主要實驗試劑16
• 2.1.3 主要溶液配制16-17
• 2.1.4 主要儀器與設(shè)備17
• 2.2 實驗方法17-27
• 2.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)與凍存17-18
• 2.2.2 引物設(shè)計和合成18
• 2.2.3 感受態(tài)細(xì)菌的制備18-19
• 2.2.4 重組質(zhì)粒的提取與鑒定19-20
• 2.2.5 腺病毒載體的構(gòu)建20-22
• 2.2.6 腺病毒的包裝、擴(kuò)增及純化22-24
• 2.2.7 TCID50法測定病毒滴度24
• 2.2.8 RT-PCR檢測EJ和T24的CD46表達(dá)24-26
• 2.2.9 重組腺病毒對EJ和T24感染效率的測定26
• 2.2.10 重組腺病毒對EJ和T24細(xì)胞作用的比較26
• 2.2.11 統(tǒng)計學(xué)分析26-27
• 三 結(jié)果27-34
• 3.1 重組質(zhì)粒的鑒定27-29
• 3.2 病毒的包裝、鑒定及滴度測定29-31
• 3.3 RT-PCR檢測CD46的表達(dá)31
• 3.4 腺病毒體外抗增殖效應(yīng)31-34
• 四 討論34-37
• 五 結(jié)論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-43
• 綜述：口頰黏膜在尿道重建中的應(yīng)用43-49
• 參考文獻(xiàn)47-49
• 在學(xué)期間的研究成果49-50
• 致謝50

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本文編號：306566