第一部分建立三重實時熒光定量PCR方法檢測人腺病毒2,3,7型目的:建立三重實時熒光定量PCR(qPCR)方法,實現(xiàn)單管一次同時檢測人腺病毒(HAdV)2,3,7型,為臨床實驗室檢測HAdV 2,3,7型提供快速、便捷的分子診斷方法。方法:(1)首先從GenBank中下載HAdV全基因組序列和2型3型7型的Hexon基因序列。(2)從已報道文獻中找到HAdV分型通用引物,通過Vector NTI比對HAdV全基因組序列和2,3,7型Hexon基因序列,找到包括HAdV 2,3,7型保守區(qū),在保持已報道通用上游引物不變的同時,用oligo7.0重新設(shè)計下游引物以達到實時熒光定量PCR對產(chǎn)物長度的要求。(3)通過以上的比對結(jié)果,找到2,3,7型不同區(qū)域分別設(shè)計探針。(4)對PCR引物和探針濃度,退火溫度,靈敏度特異性進行驗證分析。(5)采用已建立的多重qPCR方法檢測138份HAdV陽性臨床標本,并用巢氏PCR方法測序分型驗證。結(jié)果:本研究成功的建立了一種三重檢測HAdV2,3,7型的qPCR方法,該方法的靈敏度是每反應(yīng)100拷貝含目的片段的重組質(zhì)粒。該檢測方法的特異性良好,不與常見呼吸道病原體和非HAdV2,3,7型的其它血清型發(fā)生交叉反應(yīng)。該方法的組內(nèi)差異和組間差異分別是0.6%和3.6%。該方法和巢氏PCR測序方法同時檢測138份HAdV陽性臨床標本的一致性是96.38%(133/138)。結(jié)論:本研究建立的三重qPCR方法能夠快速、便捷、準確的實現(xiàn)單管同時檢測HAdV 2,3,7型,且具有潛在的臨床應(yīng)用價值。第二部分非腸道腺病毒與兒童腹瀉關(guān)系的研究目的:腸道腺病毒40,41型現(xiàn)已證實會引起腹瀉的發(fā)生,關(guān)于非腸道腺病毒和腹瀉的關(guān)系還沒有確切的結(jié)論,部分研究表明能在腹瀉標本中檢測到非腸道腺病毒散發(fā)存在。本研究旨在運用病例-對照研究方法探討非腸道腺病毒與腹瀉發(fā)生的關(guān)系。方法:收集河北省兒童醫(yī)院腹瀉患兒糞便標本273份,外科住院且近半月無腹瀉病史兒童糞便標本361份。運用實時熒光定量PCR(qPCR)方法對634份臨床標本進行腺病毒(HAdV)篩查并通過建立標準曲線對陽性標本進行定量,同時對HAdV陽性標本進行巢氏PCR擴增后測序分型。并且對腹瀉組非腸道腺病毒陽性標本進行常見腹瀉相關(guān)病原普篩查,排除其他腹瀉相關(guān)病原普干擾。通過比值比(OR)計算HAdV各血清型發(fā)生腹瀉的危險因素。結(jié)果:HAdV在腹瀉組中的陽性檢出率是28.94%(79/273)其中包括血清型40,41,3,2,1,5和57型,以40,41和3型最為多見。對照組兒童中HAdV的陽性檢出率是7.20%(26/361)主要包括血清型40,41,3,2,1,5,57,6和31型。其中HAdV陽性腹瀉組中小于3歲的患兒占91.14%,對照組占65.38%。腸道腺病毒41型病毒載量在兩組人群中無明顯差異(Z=-0.157,P=0.875)。非腸道腺病毒3型是兒童發(fā)生腹瀉的危險因素(OR=9.205,P0.001)。結(jié)論:感染HAdV 3型患兒可能會引起腹瀉的發(fā)生。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R725.1;R440
【部分圖文】：

圖 1 三重 qPCR 方法檢測 HAdV2，3，7 型靈敏度結(jié)果及標準曲線的建立。Fig.1 Sensitivity of triple qPCR for detection of HAdV2, 3, 7 andestablishment of standard curve. A (HAdV 2 sensitivity result) B (HAdV 3Sensitivity result) C (HAdV 7 sensitivity result) D (HAdV 2, 3, 7 standardcurve).

圖 2 模擬 HAdV 2，3，7 血清型三重感染靈敏度結(jié)果及標準曲線的建立。Fig.2 Simulated sensitivity of HAdV type 2, 3, 7 triple infection andestablishment of standard curve. The left figure shows the sensitivity ofHAdV type 2, 3 and 7, while the right figure shows the standard curve.4 三重 qPCR 方法特異性結(jié)果將人鼻病毒、副流感病毒、人博卡病毒、冠狀病毒、甲型流感病毒、人偏肺病毒、支原體和衣原體以及 HAdV A (31), B (55), C (1,5,6), E (4)等血清型用于三重 qPCR 方法特異性的評估，結(jié)果顯示本方法與其他常見呼吸道病原體以及 HAdV A (31), B (55), C (1,5,6), E (4)等無交叉反應(yīng)，結(jié)果如圖 3 所示。

圖 3 三重 qPCR 方法特異性結(jié)果圖Fig. 3 Specific results of triple qPCR qPCR 方法重復(fù)性結(jié)果目的片段的 HAdV 2，3，7 型質(zhì)粒作為模板，運用三重 qPCR 107、105、103copy/μL 的質(zhì)粒進行檢測，檢測結(jié)果顯示該方異系數(shù)在 0.6-3.6，組間變異系數(shù)為 1.0-3.6，具有良好的重復(fù) 7 表 8。表 7 三重 qPCR 方法批內(nèi)重復(fù)數(shù)據(jù)e 7 Intra-assay of coefficient of variation(CV) of the tq-PCR.107copy/μl 105copy/μl 103copy/μl
【參考文獻】

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1 Sudesh Kumar Arya;Badri Prasad Badhu;Ritu Amatya;V G Ramachandran;Poonam Lavaju;;臨床表現(xiàn)罕見的流行性角結(jié)膜炎1例:腺病毒角結(jié)膜上皮炎(英文)[J];國際眼科雜志;2009年08期

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本文編號：2879339