研究背景:腫瘤放射治療(放療)是利用放射線來(lái)控制甚至殺滅腫瘤的一種局部治療方法,是癌癥治療的三大常規(guī)手段之一,在腫瘤的治療中起著重要的作用。然而放療在殺滅腫瘤細(xì)胞、提高患者生存率的同時(shí),對(duì)放療區(qū)域內(nèi)其他組織也造成了不可避免的損傷,其中放射性骨損傷是較為常見的放療并發(fā)癥。放射可以造成骨質(zhì)疏松、骨萎縮、骨壞死及病理骨折等,文獻(xiàn)資料及本實(shí)驗(yàn)室的既往研究均表明放射可以導(dǎo)致骨髓內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)數(shù)量減少,并促使其向成脂方向分化。同時(shí),成骨細(xì)胞對(duì)于放射極其敏感,在接受放射線后迅速凋亡,導(dǎo)致成骨減少,骨質(zhì)疏松,甚至病理骨折。由于腫瘤病人往往年齡較大并合并其他基礎(chǔ)疾病,放療后發(fā)生骨折的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加,而放療后骨折往往愈合緩慢,并有很大概率發(fā)展為延遲愈合甚至不愈合。文獻(xiàn)報(bào)道患有軟組織惡性腫瘤的患者放療部位骨折的愈合時(shí)間超過(guò)一年,骨折不愈合率超過(guò)45%,這給患者帶來(lái)巨大的痛苦,增加死亡率,增加整個(gè)社會(huì)醫(yī)療支出。因此更深入的研究放射性骨損傷發(fā)生的機(jī)制,探尋有效的預(yù)防及治療措施,成為人們目前研究的重點(diǎn)。目前對(duì)于放療的研究普遍采用小動(dòng)物全身放療方式,然而全身放療對(duì)整個(gè)身體造成嚴(yán)重?fù)p傷,尤其是抑制造血系統(tǒng),影響骨髓造血并抑制免疫反應(yīng),這些因素都極大地干擾了對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋。為了克服這一缺點(diǎn),美國(guó)約翰霍普金斯大學(xué)的研究人員研制了小動(dòng)物精確放療平臺(tái)(SARRP)。該平臺(tái)采用活體多模式圖像引導(dǎo)微焦點(diǎn)輻照系統(tǒng),通過(guò)形成高分辨率CT三維影像,進(jìn)行活體定位,對(duì)定位目標(biāo)進(jìn)行精準(zhǔn)放療,減少了對(duì)周圍組織的輻射,可靠、安全、精確、可重復(fù)性好,目前已廣泛應(yīng)用于放療的動(dòng)物研究。骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,需要大量的分子、因子與細(xì)胞的參與,所有的過(guò)程高度協(xié)調(diào)并有序進(jìn)行,最終恢復(fù)骨骼的正常生理結(jié)構(gòu)及功能。最近的一項(xiàng)研究通過(guò)細(xì)胞宗譜追蹤實(shí)驗(yàn)證實(shí)參與構(gòu)成骨痂的細(xì)胞大部分來(lái)自于骨外膜,在骨折發(fā)生后,骨外膜內(nèi)的祖細(xì)胞分裂增殖,并分化為軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞,進(jìn)一步形成骨痂。同時(shí)組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)骨外膜分為兩層,外層的纖維層和內(nèi)層的生發(fā)層,而參與構(gòu)成骨痂的祖細(xì)胞大部分位于生發(fā)層。生發(fā)層祖細(xì)胞的正常功能受著諸多因素的影響,其中血液供應(yīng)起到了非常重要的作用。血液循環(huán)為骨折愈合提供必要的氧氣及養(yǎng)料,并將祖細(xì)胞等帶入骨痂中,保證骨折愈合的正常進(jìn)行。同時(shí)研究人員發(fā)現(xiàn)氧氣濃度對(duì)于祖細(xì)胞的分化能力及分化方向同樣具有重要影響。骨折愈合過(guò)程中任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)差錯(cuò),都將對(duì)骨折愈合造成影響,據(jù)報(bào)道約有5%-10%的骨折患者發(fā)生骨折延遲愈合的現(xiàn)象,其中很多患者最終發(fā)展為骨折不愈合,而骨折不愈合的治療一直是臨床難題。因此在本研究中,我們?cè)噲D利用小動(dòng)物精確放療平臺(tái)建立放療后骨折愈合動(dòng)物模型,通過(guò)此模型進(jìn)一步觀察骨折愈合過(guò)程并探究其潛在機(jī)制。研究目的:我們利用小動(dòng)物精確放療平臺(tái)建立放療后骨折愈合動(dòng)物模型,來(lái)模擬臨床放療中患者發(fā)生骨折,通過(guò)分析小鼠骨折的愈合過(guò)程,確定放療后骨折愈合的特點(diǎn)(第一部分),并綜合分析影響骨折愈合的因素,進(jìn)一步探尋放射后骨折愈合的機(jī)制(第二部分)。研究方法:第一部分1.動(dòng)物模型:采用二月齡大雄性C57BL/6小鼠,利用小動(dòng)物精準(zhǔn)放療平臺(tái)(SARRP)于小鼠右側(cè)脛骨中段給予8Gy劑量的放射,兩天后,相同部位再次接受8Gy的局部放射,劑量總計(jì)16Gy。小鼠的左側(cè)脛骨作為未放射對(duì)照。放射后2周,于雙側(cè)脛骨中段制造橫行穩(wěn)定型骨折,于術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠并收取脛骨,分別行microCT掃描、組織學(xué)及機(jī)械力學(xué)檢測(cè)。2.microCT掃描:使用viva CT40掃描收取的脛骨骨折標(biāo)本,分辨率為10.5μm,根據(jù)掃描圖像進(jìn)行二維及三維分析。為計(jì)算骨痂中血管體積,行microfil灌注實(shí)驗(yàn),并分別于脫鈣前后進(jìn)行掃描。3.機(jī)械力學(xué)測(cè)試:收取骨折后6周標(biāo)本行三點(diǎn)彎曲測(cè)試,記錄受力-位移曲線,并以此曲線計(jì)算最大受壓力、結(jié)構(gòu)強(qiáng)度、能量吸收值。4.組織學(xué):將于各時(shí)間點(diǎn)收取的脛骨骨折標(biāo)本分別準(zhǔn)備石蠟切片或冰凍切片,行番紅固綠染色,HE染色,天狼星紅染色,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色及免疫組化染色(Osteocalcin、、Osterix、二型膠原及Sox9)。5.人類萎縮性骨折不愈合標(biāo)本:收集人類萎縮性骨折不愈合標(biāo)本,行石蠟包埋、切片,并行番紅固綠染色,HE染色,天狼星紅染色及免疫組化染色(Osteocalcin)。6.統(tǒng)計(jì)學(xué):所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。對(duì)于同一小鼠的放射側(cè)(右側(cè))及未放射側(cè)(左側(cè))的比較,以及同一脛骨的近端與遠(yuǎn)端的比較,均應(yīng)用配對(duì)的雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)軟件采用Prism 5。P0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第二部分1.動(dòng)物模型:采用二月齡大雄性Col2/Tomato、αSMA/Tomato及Gli1/Tomato小鼠,利用小動(dòng)物精準(zhǔn)放療平臺(tái)(SARRP)于小鼠右側(cè)脛骨中段給予8Gy劑量的放射,兩天后,相同部位再次接受8Gy的局部放射,劑量總計(jì)16Gy。小鼠的左側(cè)脛骨作為未放射對(duì)照。放射后2周,于雙側(cè)脛骨中段制造橫行穩(wěn)定型骨折,于術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠并收取脛骨,行組織學(xué)檢測(cè)。2.組織學(xué):將于各時(shí)間點(diǎn)收取的脛骨骨折標(biāo)本分別準(zhǔn)備石蠟切片或冰凍切片,行番紅固綠染色,HE染色,天狼星紅染色及免疫組化染色。對(duì)于EdU實(shí)驗(yàn),在小鼠處死前3小時(shí)給予EdU注射,收集標(biāo)本行相應(yīng)染色。3.細(xì)胞學(xué):收取小鼠原代骨外膜細(xì)胞,將細(xì)胞置于四種不同環(huán)境(不放射+正常氧氣;不放射+缺氧;放射+正常氧氣;放射+缺氧)中,分別行細(xì)胞計(jì)數(shù)、成骨分化及成軟骨分化分析,并行染色及實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)。4.統(tǒng)計(jì)學(xué):所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。對(duì)于同一小鼠的放射側(cè)(右側(cè))及未放射側(cè)(左側(cè))的比較,以及同一骨的近端與遠(yuǎn)端的比較,均應(yīng)用配對(duì)的雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)。對(duì)于細(xì)胞學(xué)各組之間比較采用非配對(duì)的雙尾學(xué)生t檢驗(yàn),并使用Bonferroni校正法調(diào)整。統(tǒng)計(jì)軟件采用Prism 5。P0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:第一部分:1.骨折前放療導(dǎo)致骨折不愈合。通過(guò)microCT掃描發(fā)現(xiàn),骨折后6周,未放射組小鼠骨折已完全愈合,骨折線消失,而放射組小鼠仍可見明顯骨折線,通過(guò)計(jì)算骨折愈合指數(shù)及三點(diǎn)彎曲試驗(yàn),進(jìn)一步證明了放射后骨折不愈合。我們進(jìn)一步觀察到放射組小鼠骨折線近端有骨痂形成,但體積明顯較未放射組近端骨痂縮小,而骨折遠(yuǎn)端未見明顯骨性骨痂形成。骨折愈合后期,放射組小鼠近端骨痂向遠(yuǎn)端生長(zhǎng),但未與遠(yuǎn)端皮質(zhì)骨相連,骨折仍未愈合。2.放射造成骨折遠(yuǎn)端纖維組織積聚。我們進(jìn)一步行組織學(xué)檢查,發(fā)現(xiàn)放射組小鼠骨折近端骨痂形成延遲,但仍有軟骨組織及骨組織形成;骨折遠(yuǎn)端無(wú)骨痂形成,而是大量的纖維組織積聚。該纖維組織中分布有長(zhǎng)梭形的細(xì)胞,細(xì)胞外基質(zhì)中含有大量的一型膠原。纖維組織持續(xù)存在于骨折遠(yuǎn)端,無(wú)法消除,阻礙骨折愈合。3.纖維組織不具有成骨及成軟骨分化的能力,缺乏血液供應(yīng)。對(duì)骨痂及纖維組織分別行成骨指標(biāo)(Osteocalcin及Osterix)及成軟骨指標(biāo)(二型膠原及Sox9)免疫組化染色,結(jié)果顯示骨痂中可見陽(yáng)性染色,而纖維組織均為陰性。Endomucin染色及microfil灌注實(shí)驗(yàn)證實(shí)纖維組織中缺乏血液供應(yīng)。4.纖維組織與人類骨折不愈合的纖維瘢痕組織具有共同的性質(zhì)。我們收取人類骨折不愈合的纖維瘢痕組織,行番紅固綠染色,HE染色,天狼星紅染色及Osteocalcin免疫組化染色,顯示纖維瘢痕組織具有同小鼠纖維組織相同的細(xì)胞形態(tài),其中無(wú)血管形成,細(xì)胞外基質(zhì)中含有豐富一型膠原,無(wú)Osteocalcin表達(dá),證實(shí)該纖維瘢痕組織與小鼠中形成的纖維組織具有共同的性質(zhì)。第二部分:5.放射造成骨外膜祖細(xì)胞數(shù)量減少。在Col2/Tomato小鼠中,骨外膜細(xì)胞可以被Tomato熒光蛋白標(biāo)記,我們收集放射后2周放射組及未放射組小鼠完整脛骨標(biāo)本,通過(guò)熒光顯微鏡觀察骨外膜內(nèi)熒光分布,證實(shí)放射區(qū)域內(nèi)骨外膜祖細(xì)胞數(shù)量明顯減少,而未放射區(qū)域并無(wú)差別。同時(shí)Endomucin染色顯示放射區(qū)域內(nèi)血管也明顯減少,未接受放射的區(qū)域未受影響。6.放射后骨折前期骨外膜反應(yīng)受到抑制。骨折后三天骨外膜祖細(xì)胞分裂增殖,骨外膜增厚。而放射組脛骨骨折兩端骨外膜增厚程度減弱,同時(shí)行EdU染色同樣顯示EdU陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少,證實(shí)進(jìn)行分裂的細(xì)胞數(shù)目減少,尤以骨折遠(yuǎn)端為甚。體外實(shí)驗(yàn)顯示放射及缺氧均可明顯抑制骨外膜細(xì)胞的成骨分化能力,而缺氧可以非常顯著地促進(jìn)骨外膜細(xì)胞的成軟骨分化能力。7.纖維組織來(lái)自骨骼外的其他組織。我們利用細(xì)胞宗譜追蹤方法探尋纖維組織的來(lái)源。Co12/Tomato及αSMA/Tomato小鼠模型中,Tomato陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于骨外膜內(nèi)層即生發(fā)層,而纖維層無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞,未放射組小鼠骨痂中包含大量的Tomato陽(yáng)性細(xì)胞,證實(shí)是由Tomato陽(yáng)性細(xì)胞形成,放射組小鼠近端骨痂仍主要由Tomato陽(yáng)性細(xì)胞構(gòu)成,而遠(yuǎn)端的纖維組織為Tomato陰性,證明纖維組織并非來(lái)自骨組織。而Gli1/Tomato小鼠模型中,生發(fā)層中有少量的細(xì)胞為Tomato陽(yáng)性,大部分的Tomato陽(yáng)性細(xì)胞分布于纖維層,骨折后形成的纖維組織卻為Tomato陽(yáng)性,同時(shí)我們未觀察到骨折后纖維層有明顯的增厚,我們進(jìn)一步通過(guò)手術(shù)徹底去除骨外膜,包括纖維層及生發(fā)層,并制造骨折,同樣觀察到相同的纖維組織形成,證實(shí)纖維組織來(lái)自于骨骼外的其他組織中表達(dá)Gli1的細(xì)胞。結(jié)論:1.骨折前放射造成骨折不愈合,并于骨折遠(yuǎn)端形成大量纖維組織積聚。2.纖維組織缺乏成骨及成軟骨分化能力,缺乏血管,與人類骨折不愈合患者的纖維瘢痕組織具有相同的性質(zhì)。3.放射造成骨外膜內(nèi)祖細(xì)胞及血管損傷,并抑制骨折后骨膜反應(yīng)。4.纖維組織來(lái)源于骨骼外的其他組織中表達(dá)Gli1的細(xì)胞。6.我們建立了放射后骨折愈合及萎縮性骨折不愈合小鼠模型,該動(dòng)物模型穩(wěn)定性好、手術(shù)創(chuàng)傷小,不僅可以用于放療骨損傷的研究,同時(shí)也可以用于萎縮性骨折不愈合的研究。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R683;R730.55
【部分圖文】：

成了不可避免的損傷，其中放射性骨損傷是較為常見的放療并發(fā)癥。由于骨骼的??分布位置，臨床上用于治療位于頭頸部、乳腺、盆腔、四肢及血液系統(tǒng)腫瘤的放??療所引發(fā)的骨骼損傷十分常見（圖１）。骨組織對(duì)于輻射劑量的吸收是驚人的，研??究發(fā)現(xiàn)在接受盆腔放療的患者中，骨盆對(duì)于放射劑量的吸收比例甚至可以高達(dá)總??劑量的６０％－７０％［２，?３］。放射可以造成骨質(zhì)疏松、骨萎縮、骨壞死及病理骨折等??［２，?４－６］，對(duì)患者的日常生活產(chǎn)生很大影響。??Ｌ■編’??圖１：接受盆腔放療的患者，放療范圍（紅框所示）覆蓋骨盆的大部分結(jié)構(gòu)，??包括髖臼及股骨頭，數(shù)年后影像學(xué)資料顯示患者出現(xiàn)股骨頭壞死（紅色短箭頭所??示）及髖臼的不全骨折（紅色長(zhǎng)箭頭所示）［７］。??目前針對(duì)放射性骨損傷發(fā)生的機(jī)制及其后續(xù)表現(xiàn)有著諸多的研宄，放療對(duì)骨??１６??

??（圖３左）。該平臺(tái)采用活體多模式圖像引導(dǎo)微焦點(diǎn)輻照系統(tǒng)（Ｍｕｌｔｉ－ｍｏｄａｌｉｔｙ??Ｉｍａｇｅ?Ｇｕｉｄｅｄ?Ｍｉｃｒｏ－Ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ），通過(guò)形成高分辨率ＣＴ三維影像，進(jìn)行精確活體??定位，然后對(duì)定位目標(biāo)進(jìn)行精準(zhǔn)放療，定位精度可以達(dá)到０．?２毫米（圖３右），??同時(shí)可以根據(jù)放射部位的大小選擇不同的放射直徑，在輻射區(qū)域內(nèi)達(dá)到適形劑量??分布，減少了對(duì)周圍組織的輻射，可靠、安全、精確、可重復(fù)性好，目前已有多??個(gè)研宄中心利用該平臺(tái)進(jìn)行放療與惡性腫瘤的研宄，并已發(fā)表高質(zhì)量文章Ｂｉ？??ａｓ］。?我們同時(shí)考慮到放療損傷與放射劑量有很強(qiáng)相關(guān)性，?在放射總劑量相同的??情況下，劑量分割、多次放療對(duì)于骨組織的損害，顯著低于單次大劑量放療造成??的損害［４６

?骨外膜覆蓋，關(guān)節(jié)表面、肌腱附著點(diǎn)等處并無(wú)骨外膜覆蓋，并且臨近骨骺部骨外??膜厚度較厚，而骨干部較薄。組織學(xué)可將骨外膜分為兩層（如圖１）：外層（纖維??層，Ｆｉｂｒｏｕｓ?ｌａｙｅｒ）位于骨外膜最外面，主要由成纖維細(xì)胞、少量干細(xì)胞［９５］、膠??原蛋白（主要為一型、二型及７＾型）及彈性蛋白等構(gòu)成［９６－９８］，并有神經(jīng)及微??血管分布［９９，?１００］，該層主要起維持結(jié)構(gòu)的功能［１０１］。內(nèi)層又稱為生發(fā)層??（Ｃａｍｂｉｕｍｌａｙｅｒ），直接覆蓋于皮質(zhì)骨表面，該層細(xì)胞密度高，包括具有多向分??化能力的祖細(xì)胞，成骨細(xì)胞，成纖維細(xì)胞等［９４］，并且有較為豐富的微血管系統(tǒng)??及交感神經(jīng)系統(tǒng)［９９，１００］。研究證實(shí)生發(fā)層對(duì)于骨骼的生長(zhǎng)及修復(fù)具有重要作??用［９２，１０２－１０４］，具有成骨及成軟骨能力的祖細(xì)胞主要分布于該層，骨折發(fā)生??后
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