背景及目的:基孔肯雅病毒(chikungunya virus,CHIKV)、登革病毒(dengue virus,DENV)、西尼羅病毒(West Nile virus,WNV)、黃熱病毒(yellow fever virus,YFV)、日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)和寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)是常見的六種蟲媒病毒,主要通過蚊蟲叮咬的方式在人群中廣泛傳播,它們?cè)谌蚍植紡V泛,感染人數(shù)眾多,帶來嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān)。它們?cè)诟腥救梭w后,會(huì)引起發(fā)熱、皮疹、乏力等類似的臨床表現(xiàn),給臨床醫(yī)生進(jìn)行疾病的早期鑒別診斷帶來一定困難。此外,共感染病例的出現(xiàn),給臨床診斷和治療帶來巨大挑戰(zhàn),極易導(dǎo)致漏診、誤診。目前,常用的檢測(cè)方法,由于受到各種因素的影響,不能完全滿足臨床的需求。因此開發(fā)一種新的鑒別診斷方法,對(duì)該類疾病的診斷、治療、預(yù)防與控制具有重要意義。近年發(fā)展起來的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,q PCR),它具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好等特點(diǎn),受到人們廣泛關(guān)注。本研究基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),探索建立一種能同時(shí)檢測(cè)上述六種蟲媒病毒的方法,提高檢測(cè)效率,為臨床診斷提供一種新的快速檢測(cè)方法。方法:從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫中下載CHIKV、DENV、WNV、JEV、ZIKV和YFV基因序列,用MEGA7.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析。針對(duì)CHIKV-E3、DENV3'-UTR、WNV-NS2A、YFV5'-UTR、JEV5'-UTR、ZIKV-E基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針。利用標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和病毒RNA模板進(jìn)行多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢驗(yàn),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,并評(píng)價(jià)各體系的特異性、靈敏度和重復(fù)性。結(jié)果:設(shè)計(jì)的引物探針相互之間沒有交叉非特異性擴(kuò)增。檢測(cè)CHIKV、DENV、WNV、YFV、JEV和ZIKV的檢測(cè)下限為5拷貝/反應(yīng)和10-3～10-1TCID50/反應(yīng)之間。循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct)與起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)和病毒滴度的對(duì)數(shù)的相關(guān)系數(shù)都在0.99以上。用不同稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒分別進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè),每個(gè)稀釋度中Ct值的變異系數(shù)均小于4%。對(duì)收集到的31份疑似感染蟲媒病毒的臨床樣本用新建立的方法進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),樣本陽性率為87.1%(27/31),與商品化試劑盒的檢測(cè)結(jié)果一致,符合率為100%。這些樣本中沒有共感染病例的出現(xiàn)。用這種方法去檢測(cè)樣本,最快可在2小時(shí)內(nèi)完成。結(jié)論:我們成功地建立了一種能同時(shí)檢測(cè)CHIKV、DENV、WNV、YFV、JEV和ZIKV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,并具有特異性好、靈敏性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。該方法可以用于臨床樣本檢測(cè),有一定的實(shí)用價(jià)值。
【學(xué)位單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R440
【部分圖文】：

體系引物特異性驗(yàn)證結(jié)果

圖 2.多重?zé)晒舛?PCR 檢測(cè)方法靈敏度驗(yàn)證（標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒）我們將測(cè)定好的 TCID50 的不同病毒統(tǒng)一稀釋到 2×104TCID50/ml，然后提取病毒 RNA，再進(jìn)行 10 倍比等比稀釋。利用稀釋好的病毒 RNA 對(duì)我們建立的多重 qPCR 方法進(jìn)行靈敏度檢測(cè)。圖 3 展示的是該方法對(duì) CHIKV-RNA、YFV-RNA、JEV-RNA、ZIKV-RNA 的檢測(cè)結(jié)果，我們可以看到各自典型的擴(kuò)增曲線，且不同稀釋度的病毒滴度的對(duì)數(shù)與 Ct 值之間存在良好的線性關(guān)系，其R2值都在 0.99 以上。我們得到了各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線曲線方程，往后，我們通過實(shí)驗(yàn)檢測(cè)樣本的 Ct 值，代入到方程中，就能估算樣本的病毒滴度。通過該實(shí)驗(yàn)我們可以發(fā)現(xiàn)：針對(duì) CHIKV 的檢測(cè)下限為 10-2TCID50/反應(yīng)；針對(duì) YFV-BJ01和 YFV-SH01 的檢測(cè)下限都為 10-2TCID50/反應(yīng)；針對(duì) JEV 的檢測(cè)下限為 10-

30圖 3.多重?zé)晒舛?PCR 檢測(cè)方法靈敏度驗(yàn)證（病毒 RNA）3.4 重復(fù)性檢測(cè)對(duì)濃度為 106～100拷貝數(shù)/μl 的 CHIKV、DENV、WNV、YFV、JEV、ZIKV 基因重組質(zhì)粒，分別進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù) 3 次，根據(jù) Ct 值計(jì)算平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系
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本文編號(hào)：2874426