葉酸屬B族維生素一員,是細(xì)胞分裂和維持細(xì)胞活性的重要組分,具有輔助轉(zhuǎn)運(yùn)一碳單位的功能。葉酸缺乏是誘發(fā)巨幼紅細(xì)胞貧血、神經(jīng)管畸形、先天性心臟缺陷和某些心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素。因此建立快速、便捷、準(zhǔn)確的葉酸水平檢測(cè)方法,對(duì)于提高全民健康水平、開展優(yōu)生優(yōu)育以及葉酸強(qiáng)化產(chǎn)品的市場(chǎng)監(jiān)管,均有著重要的意義。本課題通過碳二亞胺法,將葉酸和牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白分別偶聯(lián)合成了葉酸免疫原(FA-BSA、FA-BSA-ACA)和包被原(FA-OVA),蛋白濃度分別為12.59 mg/mL、10.8 mg/mL、9.71mg/mL。經(jīng)紫外掃描進(jìn)行了效果鑒定,并利用OPA法測(cè)得偶聯(lián)比分別為13.16:1、8.90:1和4.22:1。使用FA-BSA與佐劑乳化后皮下注射的方法免疫小鼠,四次免疫后測(cè)定效價(jià)為1:60000,間接競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)的IC50為0.695μg/mL;抗體效價(jià)和性能均優(yōu)于FA-BSA-ACA的免疫結(jié)果。因此取FA-BSA免疫后的小鼠脾細(xì)胞與培養(yǎng)的SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合試驗(yàn),融合后7天獲得了能夠生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞,兩周后進(jìn)行ELISA試驗(yàn)檢測(cè)上清,共有60孔陽性。將陽性孔內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋,最終檢測(cè)上清無明顯變化,考慮可能為雜交瘤細(xì)胞分泌抗體功能丟失。利用FA-BSA免疫家兔制備多克隆抗體,家兔血清效價(jià)為1:128000,間接競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)的IC50為59.91μg/mL。采用親和層析純化兔血清中抗葉酸的多克隆抗體,經(jīng)BCA法定量蛋白濃度為0.63mg/mL,并在此基礎(chǔ)上使用棋盤法確認(rèn)最適抗原抗體工作條件,包被濃度為2 μg/mL,多抗?jié)舛葹?.27μg/mL,二抗最適稀釋度為1:2000。在純化抗體的基礎(chǔ)上建立葉酸間接ELISA檢測(cè)方法并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,其方程為Y=-0.4924X+0.3819,R2 值為 0.993,IC50 為 5.965 μg/mL�；厥章试� 83.333%-98.627%之間,批內(nèi)變異系數(shù)在5.677%-8.553%之間,批間變異系數(shù)在5.217%-9.392%之間,對(duì)比未純化的抗體檢測(cè)效果有明顯提高。
【學(xué)位單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R446.6
【部分圖文】：

第１章?引言第１章引言??詞是對(duì)蝶酰－Ｌ－谷氨酸的各種衍生形態(tài)的統(tǒng)稱。天ｆｏｌａｔｅ）由Ｗｉｌｌｓ?Ｌ于１９３１年首次發(fā)現(xiàn)【１］，隨后，［２］。葉酸又稱蝶酰谷氨酸，分子量為４４１．４０，分子組成，對(duì)氨基苯甲酸和喋啶構(gòu)成葉酸的活性部分蝶個(gè)羧基基團(tuán)。??

ＦＶ？Ｓ＼??圖２－１合成路線圖??Ｆｉｇｕｒｅ２－１?Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?ｓｃｈｅｍｅ??化??平秤�。矗矗恚缛~酸，溶解于２．５?ｍＬ?ＰＢＳ溶液中，調(diào)節(jié)溶液ｐＨ至溶解，補(bǔ)足溶液體積至０．３?ｍＬ。加入１５ｍｇ?ＥＤＣ，避光于室溫離心ｌＯｍｉｎ，保存上清。??配制??平秤�。叮叮恚�?ＢＳＡ?，借助渦旋攪拌器，充分溶解于０．２?ｍＬ?ＰＢＳ溶１０?ｍｉｎ，保存上清。??疫原制備??后的ＦＡ溶液，緩慢逐滴加入ＢＳＡ溶液中，室溫避光緩慢搖晃３ｈ

圖２－２?ＦＡ、ＭＴＸ結(jié)構(gòu)示意圖??Ｆｉｇｕｒｅ２－２?ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ?ｆｏｒｍｕｌａｓ?ｏｆ?ＦＡ?ａｎｄ?ＭＴＸ??鼠和ＦＡ－ＢＳＡ－ＡＣＡ免疫小鼠的血清的操作步驟均按如２．３．１的方法制備ＭＴＸ－ＯＶＡ，使用碳酸緩沖液分別將至２００叩／１００叫，在９６孔板內(nèi)每孔加１００４，４°Ｃ放置使用ＰＢＳＴ洗板，每次加入孔內(nèi)后靜置３ｍｉｎ，甩干。封閉液使用１％明膠溶液，每孔３００從，３７°Ｃ溫育２ｈ封閉后ＰＢＳＴ洗板三次，將小鼠抗ＦＡ血清１：１０００、１：〇ＨＬ；未免疫小鼠血清１：１０００稀釋，每孔１００以，ＰＢＳ溶液每孔加入１０〇ｎＬ當(dāng)做空白對(duì)照，３７°Ｃ溫育ｌｈＰＢＳＴ洗板三次后，每孔加入１：１００００稀釋的ＨＲＰ洗板三次后，每孔加入顯色液１００汕，室溫下顯色１５
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本文編號(hào)：2866147