研究背景隨著抗菌藥物的廣泛使用,細(xì)菌耐藥已成為全球嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題。近年來,革蘭氏陰性桿菌對(duì)臨床常見抗菌藥物的耐藥率呈增長趨勢,其中最多見者為大腸埃希氏菌,其對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的主要原因是超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-Spectrum β-Lactamases,ESBLs)的產(chǎn)生。中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測研究2015-2016革蘭氏陰性菌監(jiān)測報(bào)告顯示,臨床分離大腸埃希氏菌中的ESBLs檢出率為59.4%。細(xì)菌耐藥性的增強(qiáng),會(huì)導(dǎo)致感染者住院時(shí)間延長、醫(yī)療費(fèi)用增加等,給患者造成極大的負(fù)擔(dān)。有研究指出,抗菌藥物在動(dòng)物養(yǎng)殖領(lǐng)域大規(guī)模應(yīng)用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增加,也加速了耐藥菌株在動(dòng)物與人群中的傳播。在山東省,非養(yǎng)殖地區(qū)農(nóng)村居民中該菌檢出率為42%;某生豬養(yǎng)殖縣農(nóng)村居民中檢出率則高達(dá)82.5%。研究目的1.了解山東省養(yǎng)殖地區(qū)農(nóng)村居民產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌的藥物敏感性情況和β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因特點(diǎn);2.描述山東省養(yǎng)殖地區(qū)農(nóng)村居民產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌的分子分型特點(diǎn),分析耐藥菌可能的傳播途徑,為該地區(qū)抗菌藥物的使用和耐藥菌的預(yù)防與控制提供理論依據(jù)。研究方法1.菌株來源:本研究基于國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“動(dòng)物與人類細(xì)菌耐藥性相互影響、傳播與干預(yù)研究”,在山東省某生豬養(yǎng)殖縣12個(gè)村莊的居民糞便中分離到的產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌611株中,隨機(jī)選取8個(gè)村,每村隨機(jī)選取30株,共240株,并收集相關(guān)流行病學(xué)資料(包括年齡、性別、家里是否養(yǎng)豬)。2.藥物敏感性試驗(yàn):根據(jù)CLSI M100-S27標(biāo)準(zhǔn),對(duì)14種人常用抗菌藥物和1種動(dòng)物專用藥使用瓊脂稀釋法進(jìn)行抗菌藥物敏感性檢測�？咕幬镎埸c(diǎn)值均參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)M100-S27,由于CLSI未給出替加環(huán)素標(biāo)準(zhǔn),其折點(diǎn)值參照歐盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)EUCAST2017。3.β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因檢測:使用普通PCR法檢測blaCTX-M、blaSHV和blaTEM三種基因型,blaCTX-M型菌株進(jìn)一步檢測是否為CTX-M-1組和CTX-M-9組。4.分子分型:使用DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取核酸,參考MLST網(wǎng)站對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行分子分型實(shí)驗(yàn),對(duì)大腸埃希氏菌7個(gè)管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序,應(yīng)用Contig軟件和CLCsequence軟件拼接剪切,得到目標(biāo)長度序列,上傳至PubMLST國際統(tǒng)一數(shù)據(jù)庫獲得菌株ST序列型,應(yīng)用eBURSTv3.0軟件進(jìn)行聚類分析。5.全基因組測序:在相對(duì)優(yōu)勢ST型ST10的菌株中,選擇多重耐藥程度最高的菌株進(jìn)行全基因組測序分析,即耐5、6類藥物的全部12株菌株,同時(shí)在非多重耐藥菌中隨機(jī)選擇3株菌進(jìn)行對(duì)比,共納入15株ST10型產(chǎn)ESBL大腸埃希氏菌。提取DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行全基因組測序,在PATRIC網(wǎng)站拼接菌株序列,將拼接好的序列上傳至Center for Genomic Epidemiology網(wǎng)站進(jìn)行耐藥基因和毒力基因的分析;應(yīng)用CLC Genomics Workbench軟件進(jìn)行最短距離法聚類分析。主要結(jié)果1.一般情況240株產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌來自8個(gè)村240個(gè)居民,每個(gè)村30人。其中,男性占55.0%(132/240),女性占45.0%(108/240);年齡范圍在18-94歲之間;養(yǎng)豬居民占37.5%(90/240),不養(yǎng)豬居民占62.5%(150/240)。2.產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌的藥物敏感性(1)產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌對(duì)多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性,對(duì)頭孢噻肟、氟苯尼考、四環(huán)素、復(fù)方新諾明的耐藥率較高,分別為100.0%(240/240)、90.8%(218/240)、80.4%(193/240)、79.6%(191/240);對(duì)亞胺培南、美羅培南、替加環(huán)素、頭孢西丁、頭孢他啶、阿米卡星的耐藥率較低,均低于5%。(2)產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌多重耐藥率為84.2%(202/240)。耐藥譜中耐3-5類藥物的菌株占76.7%(184/240);耐6類藥物的菌株占7.5%(18/240)。3.β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因檢測CTX-M基因檢出陽性率為98.8%(237/240),TEM基因檢出陽性率為40.4%(97/240),SHV基因檢出陽性率為1.7%(4/240)。其中CTX-M基因以CTX-M-9組、CTX-M-1 組亞型為主,分別占22.9%(55/240)、18.8%(45/240)。4.分子分型240株產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌中,共檢出108個(gè)ST型。其中,以ST10最多,共32株,占 13.3%;其次分別為ST38(9/240)、ST648(8/240)、ST206(7/240)、ST48(7/240)、ST46(6/240)、ST6338(6/240)、ST744(6/240)、ST162(5/240)、ST349(5/240)。其它ST型分別有5株以下與其對(duì)應(yīng)。eBURSTv3.0軟件聚類分析結(jié)果顯示,部分試驗(yàn)菌株形成14個(gè)克隆群。其中,CC10為本研究最主要的克隆群,包括ST10、ST48、ST167等32個(gè)ST型,占36.7%(88/240)。5.全基因組測序在15株ST10型產(chǎn)ESBL大腸埃希氏菌中,β-內(nèi)酰胺酶類、四環(huán)素類耐藥基因檢出率為100.0%(15/15),氨基糖苷類、甲氧芐氨嘧啶類耐藥基因檢出率為80.0%(12/15),磺胺類耐藥基因檢出率為73.3%(11/15),大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺-鏈陽菌素類耐藥基因檢出率為60.0%(11/15),氯霉素類耐藥基因檢出率為53.3%(8/15),其它類型耐藥基因檢出率均在50.0%以下。毒力基因包括gad、iss、cma、iroN、capU等,其中g(shù)ad基因檢出率為100.0%(15/15),iss基因檢出率為60.0%(9/15),其它毒力基因檢出率均在20.0%以下。聚類分析顯示,15株ST10型產(chǎn)ESBL大腸埃希氏菌被聚為兩類,其中E004與A012、G055與A022、E042與A025三組菌株與其他菌株相比,親緣關(guān)系相對(duì)較近,每組菌株均分別來自不同村莊的居民。結(jié)論1.該養(yǎng)殖地區(qū)農(nóng)村居民產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌中頭孢噻肟、氟苯尼考、四環(huán)素、復(fù)方新諾明的耐藥情況較嚴(yán)重,應(yīng)加強(qiáng)對(duì)這四類抗菌藥物的應(yīng)用管理;2.該養(yǎng)殖地區(qū)農(nóng)村居民產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌中β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因以CTX-M為主,主要亞型是CTX-M-9組、CTX-M-1組;3.該養(yǎng)殖地區(qū)農(nóng)村居民所攜帶的產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌分子分型存在以CC10為主的小范圍聚集性,可能存在動(dòng)物與人類之間的傳播模式。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R126.4;R446.5
【部分圖文】：

Ａ０２２、Ａ０２５、Ｅ０４２、Ｇ０５５、Ｈ０１７號(hào)居民菌株僅攜帶ｇａｄ?—種毒力基因。??３．７．４聚類分析??ＣＬＣ?Ｇｅｎｏｍｉｃｓ?Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ軟件最短距離法聚類分析結(jié)果見圖３。由圖３可知，??１５株ＳＴ１０型產(chǎn)ＥＳＢＬ大腸埃希氏菌被聚為兩類，Ｄ０３５、Ｅ０Ｉ１、Ｆ００３、Ｆ０６３分??屬ｆ？一大類，其他１１株菌屬亍－人類。??其中，Ｅ００４與Ａ０Ｉ２在最短距離為０．０６２處首先聚為－類：Ａ０２２、Ｇ０５５在??最短距離為０．０３３聚為一類，在最短距離為０．００９處與Ｂ００丨、Ｃ０４６聚為－類。??Ｈ０１７、Ｈ０３８在最短距離為０．００８處聚為？類；Ａ０２５、Ｅ０４２在最短距離為０．０３０??處聚為－類，在最短距離為０．０１４處與Ｂ０６３聚為？類。前述１１株菌株在最短距??離為０．００３處聚為－大類。??Ｄ０３５與Ｅ０１１在最短距離為０．０３１處聚為－類；Ｆ００３與Ｆ０６３在最短距離為??０．０３０處聚為－類，在最短距離為０．００３處與前述２株菌聚為大類。????？?Ｅ００４???？?Ａ０１２??——??？?Ｃ０４６??????？?Ｇ０５５???？?Ａ０２２???？?Ｂ００１???？?Ｈ０１７???？?Ｈ０３８???？?Ｂ０６３????？?Ｅ０４２???？?Ａ０２５???？?Ｅ０１１???？?Ｄ０３５???？?Ｆ００３???？?Ｆ０６３???０?０６０???圖３?１５株ＳＴ１０型產(chǎn)ＥＳＢＬｓ大腸埃希氏菌聚類分析圖??注：樹形交點(diǎn)是物種之間共同祖先，遺傳距離大小用枝條表示，分支長度表不進(jìn)化距??離的大小
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本文編號(hào)：2864054