單核苷酸多態(tài)性和遺傳病發(fā)生密切相關,引起遺傳病的單核苷酸變化稱為基因突變。單基因遺傳病主要是單個或多個位點等位基因的堿基發(fā)生突變而直接導致該基因的功能缺失或減弱,從而表現(xiàn)出可遺傳的機體功能缺陷。目前基因突變檢測如DNA微陣列、質譜等方法需要繁瑣的操作步驟、較長的時間以及昂貴和復雜的儀器設備,這些方法不再適用于臨床應用中對基因突變位點的快速篩查。本研究通過結合突變擴增阻滯系統(tǒng)和金磁微粒組裝的免疫層析側向流技術,建立了一種靈敏、低成本、易于普適的多位點突變的基因分型方法,檢測結果可被磁定量檢測儀自動識別,也可以通過肉眼直觀觀察層析系統(tǒng)的檢測線上是否存在被捕獲的金磁微粒探針而產生顏色的變化,進而實現(xiàn)基因型判讀。課題選擇苯丙酮尿癥的致病關鍵酶—苯丙氨酸羥化酶為研究對象,建立了苯丙氨酸羥化酶基因7個突變位點的檢測方法,通過對所構建質粒苯丙氨酸羥化酶基因檢測效果的評價,體現(xiàn)了方法的高靈敏度和強特異性。將該方法進一步開展臨床檢測的初步應用,對于北京協(xié)和醫(yī)院收集的23個家系中苯丙酮尿癥患兒及父母雙方共69個血液樣本進行苯丙氨酸羥化酶基因突變的檢測,對比基因測序的結果,該方法檢測的一致率達到97.8%,表明該檢測方法在基因多位點突變導致的相關遺傳病篩查中具有潛在的臨床應用價值。
【學位單位】：西北大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R440
【部分圖文】：

第一章 緒論PAH，612349）及其輔酶四氫生物蝶呤（BH4）的催化作用下轉變?yōu)槔野彼�，再酪氨酸的代謝途徑轉化為黑色素、多巴胺及腎上腺素等生理活性物質[23]。苯丙氨代謝通路見圖 1-1。按基因缺陷的不同，PKU 可分為經典型和非經典型兩類。經 PKU 是由于 PAH 基因突變而導致基因功能缺陷，使苯丙氨酸不能轉化為酪氨酸病。非經典型 PKU 是由于 PAH 的輔酶 BH4合成通路障礙所引起。BH4的前體鳥磷酸及鳥苷三磷酸環(huán)化水合酶、6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶、二氫生物蝶呤還原酶呤-4α-甲醇胺脫水酶等異常都能導致 BH4缺乏。非經典型 PKU 除了典型 PKU 的表現(xiàn)之外，神經系統(tǒng)的異常表現(xiàn)比較突出，如軀干肌張力減弱、四肢肌張力增自主地運動、震顫，頑固性驚厥等[24, 25]。其中經典型 PKU 占絕大部分，占 PKU的 98%-99%[24, 26]。不同的致病原因所對應的治療方法也不同，因此，及時篩查確診斷 PKU 確切的致病原因對患者的治療至關重要。

水和絨毛細胞中不表達。因而不能通過檢測羊水中的酶活來進行 PKU 的產前診斷，只能通過檢測 PAH 基因是否突變而進行產前基因診斷[29]。因此，建立一種方便、快速、準確的 PAH 基因突變的檢測方法在臨床 PKU 診斷及治療中就十分必要。1.2 苯丙氨酸羥化酶基因概述1.2.1 苯丙氨酸羥化酶基因的分子生物學1983 年，Woo 等克隆了被公認的 PKU 致病基因——PAH 基因[30]。如圖 1-2 所示[31]，PAH 基因定位于人類染色體的 12q23.2，該區(qū)域的長度約為 1.5Mb，除了 PAH 基因外，該區(qū)域還包括其他 5 個基因[32]。PAH 基因由 13 個外顯子和 12 個內含子組成，基因全長 171266bp。轉錄時剪接內含子形成 1353bp 的編碼序列，翻譯合成包含 45個氨基酸的單體蛋白。PAH 由四個 PAH 單體蛋白通過亞基締合而成一個有功能的四聚體，作為該酶的功能單位[33, 34]。PAH 基因主要在肝臟中表達。

第一章 緒論的功能做了開創(chuàng)性的工作[35]。1999 年，Kobe 等運用質譜技術和 X 射線衍成功構建了 PAH 基因的 3D 晶體結構模型[36]。如圖 1-3 所示，PAH 基因通�；钚缘乃木垠w存在。此模型從結構生物學的角度為研究 PAH 基因突變對蛋和功能的影響機制奠定了基礎。2003 年，Scriver 等對 PAH 基因突變的數據統(tǒng)計分析，并從基因突變體外表達以及基因突變對蛋白質結構影響的角度判引發(fā)的基因功能缺失[33]。該研究發(fā)現(xiàn) PAH 基因突變的錯義突變占 63%，突分子機制是突變基因翻譯產生的蛋白質異常卷曲而導致其結構不穩(wěn)定，最終降解，造成酶催化活性的降低。還有一些突變是由于基因的異常剪接引起。剪接位點的堿基突變而導致基因的重編輯系統(tǒng)無法識別，破壞了 GT-AG 法異常的編碼序列，最終產生功能異常的蛋白。
【參考文獻】

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