目的:研究從中草藥中提取的天然藥物齊墩果酸對(duì)大鼠C6腫瘤的放射增敏作用及機(jī)制;采用正電子乏氧顯像~(18)F-氟硝基咪唑正電子發(fā)射斷層顯像-X線計(jì)算機(jī)斷層成像(~(18)F-Fluoromisonidazol Positron Emission Tomography/Computed Tomography,~(18)F-FMISO PET/CT)監(jiān)測(cè)腫瘤乏氧改變及齊墩果酸的放射增敏療效;病理檢測(cè)放射增敏治療后腫瘤組織生物學(xué)改變,旨在探討齊墩果酸增敏機(jī)制及正電子乏氧顯像~(18)F-FMISO PET/CT對(duì)腫瘤乏氧診斷及放射增敏劑療效評(píng)價(jià)的價(jià)值。方法:1.體外實(shí)驗(yàn)研究齊墩果酸對(duì)大鼠C6腫瘤細(xì)胞的放射增敏作用及機(jī)制,方法包括MTT實(shí)驗(yàn)、集落形成實(shí)驗(yàn)、Real-time PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)。MTT實(shí)驗(yàn):采用氯化鈷(CoCl_2)化學(xué)乏氧法模擬腫瘤乏氧微環(huán)境,將C6腫瘤細(xì)胞分為常氧和乏氧組,給予梯度濃度齊墩果酸藥物孵育12 h、24 h、48 h,酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定細(xì)胞吸光度,計(jì)算抑制率繪制存活曲線,軟件分析獲取齊墩果酸作用于C6腫瘤細(xì)胞24 h的半數(shù)致死劑量(Half effective inhibition concentration,IC_(50));集落形成實(shí)驗(yàn):齊墩果酸對(duì)大鼠C6腫瘤細(xì)胞放射敏感性的影響采用集落形成實(shí)驗(yàn)觀察。將20%IC_(50)及30%IC_(50)的齊墩果酸預(yù)處理常氧和乏氧C6細(xì)胞24 h后給予0~8 Gy梯度劑量照射,2周后觀察各組腫瘤細(xì)胞的集落形成率。分析計(jì)算氧增比(Oxygen enhancement ratio,OER)、齊墩果酸對(duì)腫瘤細(xì)胞放射增敏比(Sensitive enhancement ratio,SER)。Real-time PCR和Western blot實(shí)驗(yàn):20%IC_(50)及30%IC_(50)濃度齊墩果酸放射增敏治療對(duì)乏氧C6腫瘤細(xì)胞乏氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)mRNA和蛋白表達(dá)的影響分別采用Real-time PCR和Western blot法測(cè)定。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究齊墩果酸對(duì)大鼠C6腫瘤模型的放射增敏作用,以抑瘤率及荷瘤鼠生存期為療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。構(gòu)建大鼠下肢皮下C6腫瘤模型,按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、齊墩果酸組、放療組及齊墩果酸聯(lián)合放療組,每組各6只。每周測(cè)量腫瘤大小,計(jì)算腫瘤體積,繪制腫瘤體積增長(zhǎng)曲線,以治療后各組腫瘤體積均值計(jì)算抑瘤率;記錄各組荷瘤鼠死亡時(shí)間進(jìn)行生存分析。3.~(18)F-FMISO PET/CT顯像將構(gòu)建好的大鼠C6腫瘤模型按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、齊墩果酸組、放療組及齊墩果酸聯(lián)合放療組,每組各6只,用于治療前及治療后24 h的腫瘤乏氧顯像研究。PET/CT圖像分析方法采用視覺分析法結(jié)合半定量分析法,選取腫瘤放射性濃聚最濃層面,勾畫感興趣區(qū),得到腫瘤最大標(biāo)準(zhǔn)攝取值(Maximal standard uptake value of tumor,SUVmax-tumor)及同層面對(duì)側(cè)下肢正常肌肉組織最大標(biāo)準(zhǔn)攝取值SUVmax-muscle,計(jì)算腫瘤與肌肉攝取比值(Tumor muscle ratio,TMR)作為療效評(píng)估指標(biāo)。4.病理學(xué)實(shí)驗(yàn)顯像完成后,取荷瘤鼠腫瘤組織進(jìn)行病理學(xué)實(shí)驗(yàn),包括腫瘤大體觀察、HE染色、免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)染色測(cè)定指標(biāo)包括:HIF-1α、Glut-1、Ki67、P53及MVD。5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0分析上述體外實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、~(18)F-FMISO PET/CT顯像、病理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,探討齊墩果酸對(duì)C6腫瘤的放射增敏作用及機(jī)制;對(duì)~(18)F-FMISO PET/CT顯像半定量參數(shù)TMR與腫瘤生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析及回歸分析,探討~(18)F-FMISO PET/CT對(duì)腫瘤乏氧診斷及放射增敏劑對(duì)腫瘤生物學(xué)影響的可視化評(píng)估價(jià)值。結(jié)果:1.體外實(shí)驗(yàn)齊墩果酸藥物對(duì)常氧和乏氧的C6腫瘤細(xì)胞均有抑制作用,藥物濃度越高、作用時(shí)間越長(zhǎng),抑制作用越強(qiáng),細(xì)胞存活率越低;齊墩果酸對(duì)常氧C6細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于乏氧C6細(xì)胞;齊墩果酸作用于常氧和乏氧C6細(xì)胞24 h的半數(shù)致死量IC_(50)值分別為42μg/mL和68μg/mL。集落形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),梯度劑量的X線照射下,乏氧C6細(xì)胞表現(xiàn)出放射抵抗,存活率高于同劑量照射下常氧C6細(xì)胞,計(jì)算氧增比OER為1.15;20%IC_(50)及30%IC_(50)濃度的齊墩果酸對(duì)常氧和乏氧C6細(xì)胞均有放射增敏作用,20%IC_(50)齊墩果酸對(duì)常氧和乏氧C6細(xì)胞放射增敏比SER分別為1.51、1.64;30%IC_(50)齊墩果酸對(duì)常氧和乏氧C6細(xì)胞放射增敏比分別為1.72、1.87。Real-time PCR和Western blot結(jié)果示20%IC_(50)、30%IC_(50)的齊墩果酸聯(lián)合照射組乏氧C6腫瘤細(xì)胞的HIF-1αmRNA水平顯著低于單純照射組(t=3.35,5.58,P均0.05),HIF-1α蛋白水平亦顯著低于單純照射組(t=7.98,13.62,P均0.01);齊墩果酸藥物組與對(duì)照組對(duì)比,30%IC_(50)藥物濃度的齊墩果酸能有效下調(diào)乏氧C6腫瘤細(xì)胞HIF-1αmRNA水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.21,P0.05),但HIF-1α蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)治療前及治療后24 h,對(duì)照組荷瘤鼠腫瘤體積分別為(0.62±0.05,1.65±0.09)cm~3,齊墩果酸組荷瘤鼠腫瘤體積分別為(0.65±0.04,1.69±0.11)cm~3,放療組荷瘤鼠腫瘤體積分別為(0.62±0.04,0.78±0.19)cm~3,齊墩果酸聯(lián)合放療組荷瘤鼠腫瘤體積分別為(0.63±0.08,0.81±0.26)cm~3;齊墩果酸組與對(duì)照組腫瘤體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;放療組及齊墩果酸聯(lián)合放療組較對(duì)照組表現(xiàn)出明顯抑瘤作用,以體積均值計(jì)算抑瘤率分別為52.73%、51.91%;齊墩果酸聯(lián)合放療組較單純放療組腫瘤體積差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組荷瘤鼠生存期為43.67±3.3(33~52)天,齊墩果酸組荷瘤鼠生存期為44.62±3.1(35~54)天,放療組荷瘤鼠生存期為53.3±2.2(43~61)天,齊墩果酸聯(lián)合放療組荷瘤鼠生存期為56.8±2.6(44~65)天;接種腫瘤第60天時(shí)各組荷瘤鼠存活率分別為0、0、16.7%及33.3%。Kaplan-Meier生存分析法檢驗(yàn)各組荷瘤鼠生存期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ~2=12.15,P0.01)。3.~(18)F-FMISO PET/CT顯像治療前,統(tǒng)計(jì)所有荷瘤鼠腫瘤TMR水平為(1.29±0.12),以TMR1.2為乏氧標(biāo)準(zhǔn),乏氧腫瘤占腫瘤總數(shù)的比例為91.7%(22/24);治療后24 h,對(duì)照組乏氧腫瘤比率100%(6/6),齊墩果酸組乏氧腫瘤比率100%(6/6),放療組乏氧腫瘤比率66.7%(4/6),齊墩果酸聯(lián)合放療組乏氧腫瘤比率33.3%(2/6)。各組荷瘤鼠腫瘤TMR治療前后對(duì)比,結(jié)果顯示對(duì)照組荷瘤鼠腫瘤TMR值為(1.28±0.08,2.78±0.16;t=22.89,P0.01),以均值計(jì)算腫瘤TMR增長(zhǎng)率為117.18%;齊墩果酸組荷瘤鼠腫瘤TMR值為(1.29±0.16,2.61±0.22;t=17.7,P0.01),以均值計(jì)算腫瘤TMR增長(zhǎng)率為102.32%;放療組荷瘤鼠腫瘤TMR值為(1.28±0.06,1.24±0.32;t=1.09,P0.05),以均值計(jì)算腫瘤TMR降低率為3.12%;齊墩果酸聯(lián)合放療組荷瘤鼠腫瘤TMR值為(1.30±0.07,1.15±0.13;t=3.26,P0.05),以均值計(jì)算腫瘤TMR降低率為11.54%。4.病理學(xué)實(shí)驗(yàn)大體觀察,瘤體包膜完整,與周圍組織有分界,切開后腫瘤邊緣組織呈淡紅色魚肉樣,中央?yún)^(qū)域呈灰白色肉糜樣;HE染色見異型性明顯的腫瘤細(xì)胞核大深染,排列密集紊亂,壞死區(qū)域呈顆粒、條塊狀紅染;放療組及齊墩果酸聯(lián)合放療組腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、核溶解、核破裂等細(xì)胞不可逆損傷征象。免疫組化結(jié)果示對(duì)照組、齊墩果酸組、放療組及齊墩果酸聯(lián)合放療組腫瘤組織HIF-1α陽(yáng)性細(xì)胞百分率分別為(84.53±4.91,81.82±6.45,52.53±6.87,38.87±6.32)%,Glut-1陽(yáng)性細(xì)胞百分率分別為(89.24±5.88,89.87±3.94,67.25±9.76,45.09±9.61)%,Ki67陽(yáng)性細(xì)胞百分率分別為(35.57±4.39,36.52±4.62,19.53±6.78,15.85±4.83)%,P53陽(yáng)性細(xì)胞百分率分別為(53.06±10.41,52.84±11.93,27.79±12.45,30.38±13.02)%,MVD分別為(19.01±5.34,18.37±4.98,9.06±3.35,9.67±3.68);單因素方差分析各生物學(xué)指標(biāo)的組間對(duì)比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=78.83,45.94,25.43,7.98,9.25,P均0.01);LSD法兩兩組間對(duì)比結(jié)果示齊墩果酸藥物組與對(duì)照組腫瘤各生物學(xué)指標(biāo)表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,齊墩果酸聯(lián)合放療組與放療組腫瘤各生物學(xué)指標(biāo)表達(dá)對(duì)比,其中齊墩果酸聯(lián)合放療組腫瘤HIF-1α和Glut-1陽(yáng)性細(xì)胞百分率低于放療組(P0.01,P0.05),而Ki67、P53及MVD水平兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)~(18)F-FMISO PET/CT顯像半定量參數(shù)TMR與腫瘤生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析結(jié)果示TMR與HIF-1α(%)、Glut-1(%)、Ki67(%)、P53(%)、MVD呈不同程度正相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r分別為0.92、0.86、0.89、0.70、0.81,P均0.01;多元線性回歸分析法以TMR為因變量,HIF-1α、Glut-1、Ki67、P53、MVD表達(dá)結(jié)果為自變量,結(jié)果顯示腫瘤組織HIF-1α陽(yáng)性細(xì)胞百分率是TMR值的獨(dú)立影響因素(P0.01)。結(jié)論:天然藥物齊墩果酸對(duì)C6腫瘤有放射增敏作用,其主要機(jī)制與下調(diào)乏氧C6腫瘤細(xì)胞HIF-1αmRNA和蛋白表達(dá)有關(guān);齊墩果酸協(xié)同放射治療能有效抑制腫瘤體積增長(zhǎng)并延長(zhǎng)荷瘤鼠生存期;~(18)F-FMISO PET/CT顯像半定量指標(biāo)TMR能有效監(jiān)測(cè)腫瘤乏氧狀態(tài)及齊墩果酸早期增敏療效;齊墩果酸聯(lián)合放療能顯著下調(diào)腫瘤組織HIF-1α、Glut-1、Ki67、P53蛋白表達(dá)及微血管密度MVD;~(18)F-FMISO攝取程度指標(biāo)TMR與腫瘤組織HIF-1α、Glut-1、Ki67、P53、MVD表達(dá)呈不同程度正相關(guān)關(guān)系,其中HIF-1α陽(yáng)性率是TMR值的獨(dú)立影響因素。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R730.55
【部分圖文】：

安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 齊墩果酸對(duì)鼠膠質(zhì)瘤 C6 細(xì)胞增殖的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 C6 腫瘤細(xì)胞，加入 150 μg/mL、75 μg/mL、37.5 μg/mL、18.75μg/mL、9.37 μg/mL 梯度濃度 OA 分別孵育 12 h、24 h 及 48 h 后 MTT 法測(cè)定細(xì)胞存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥物濃度越高、作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制作用越強(qiáng)，細(xì)胞存活率越低（見圖 1）。以孵育 24 h 為時(shí)間節(jié)點(diǎn)計(jì)算 OA 對(duì)常氧及乏氧 C6 細(xì)胞的半數(shù)致死量 IC50值分別為 42 μg/mL 和 68 μg/mL。

圖 2. C6 細(xì)胞存活曲線圖（A：常氧 C6 細(xì)胞；B: 乏氧 C6 細(xì)胞）Figure 2. Survival fractions of C6 glioma cells in different treatment groups measuredby the colony-forming assay（A: normoxic C6 cells; B: hypoxic C6 cells）表 1. OA 對(duì) C6 細(xì)胞的放射增敏作用參數(shù)Table 1. Radiosensitizing effect of OAon normoxic and hypoxic C6 glioma cellsD0Dq SER OERNormoxic C6 cellsIR 3.72 0.87IR + 20% IC50OA 2.46 0.65 1.51IR + 30% IC50OA 2.16 0.51 1.72IR 4.27 1.28 1.15

安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3.3 OA 聯(lián)合照射對(duì)乏氧腫瘤細(xì)胞 HIF-1α mRNA 和蛋白表達(dá)的影響乏氧 C6 細(xì)胞 HIF-1α mRNA 和蛋白表達(dá)通過 Real time-PCR 和 Western blot測(cè)定（見圖 3）。20% IC50、30% IC50的 OA 預(yù)處理乏氧 C6 細(xì)胞 24 h 聯(lián)合 2 Gy照射組腫瘤 HIF-1α mRNA 顯著低于單純照射組（t = 3.35, 5.58, P 均 < 0.05）；20%IC50、30% IC50聯(lián)合 2 Gy 照射組 C6 細(xì)胞 HIF-1α蛋白表達(dá)顯著低于單純照射組 (t= 7.98, 13.62, P 均< 0. 01)。20% IC50、30% IC50的 OA 藥物組與對(duì)照組對(duì)比，30%IC50濃度 OA 有效下調(diào)乏氧 C6 細(xì)胞 HIF-1α mRNA 水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.21, P < 0.05），但 HIF-1α 蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
【參考文獻(xiàn)】

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