發(fā)布時(shí)間：2020-10-26 10:56

　　 目的:1.構(gòu)建特異性高表達(dá)MMP14蛋白的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,并利用該細(xì)胞系通過細(xì)胞SELEX技術(shù)篩選特異性識(shí)別MMP14蛋白的適配體;2.利用篩選的特異性適配體構(gòu)建磁共振和熒光的雙功能分子探針并檢測其成像效果。方法:1.通過基因合成方法構(gòu)建MMP14基因的慢病毒載體,并通過該載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞構(gòu)建特異性高表達(dá)MMP14蛋白的293T-MMP14細(xì)胞。2.通過化學(xué)合成的方法構(gòu)建一個(gè)ssDNA文庫,其中心為40個(gè)堿基的隨機(jī)序列,前后均為固定的引物序列。通過細(xì)胞SELEX技術(shù),以轉(zhuǎn)染后的293T-MMP14細(xì)胞為正篩細(xì)胞,以MMP14蛋白陰性表達(dá)的293T-Plasmid細(xì)胞為負(fù)篩細(xì)胞篩選MMP14蛋白特異性適配體,經(jīng)過12輪篩選后對篩選文庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、單克隆挑選及測序獲得適配體候選對象,通過流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證候選對象與293T-MMP14細(xì)胞的親和力;選擇親和力最高的適配體,通過流式細(xì)胞術(shù)測試Kd值用以評估其結(jié)合特異性;通過細(xì)胞免疫熒光與流式細(xì)胞術(shù)測試適配體與胰腺癌細(xì)胞系的結(jié)合能力。3.以篩選的適配體為親和組件,通過化學(xué)合成的方法在其5’端標(biāo)記Cy5,3’端標(biāo)記氨基,再與磷脂-羧基聚乙二醇修飾的磁性Fe_3O_4納米顆粒(末端標(biāo)記羧基)PEG@Fe_3O_4通過氨基羧基的縮合反應(yīng)連接,構(gòu)建標(biāo)記熒光素Cy5與磁共振對比劑Fe_3O_4的雙模態(tài)分子探針。通過細(xì)胞免疫熒光及荷瘤裸鼠模型檢測其熒光成像功能,通過磁共振掃描檢測其在細(xì)胞層面的磁共振對比成像功能。結(jié)果:1.MMP14基因慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,建立特異性高表達(dá)MMP14蛋白的293T-MMP14細(xì)胞。2.經(jīng)過12輪篩選共獲得24個(gè)有效適配體序列,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)M17適配體與293T-MMP14細(xì)胞親和力最高,其Kd值為4.98±1.26nM,處于nmol級別;通過細(xì)胞免疫熒光發(fā)現(xiàn)其可特異性結(jié)合在293T-MMP14細(xì)胞膜表面;流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)M17可特異性結(jié)合胰腺癌細(xì)胞系MIA PaCa-2與PANC-1。3.以PEG修飾的磁性納米顆粒(末端標(biāo)記羧基)PEG@Fe_3O_4為核心,通過氨基羧基縮合反應(yīng)將5’端標(biāo)記Cy5,3’端標(biāo)記氨基的Cy5-M17-氨基適配體偶聯(lián)至PEG@Fe_3O_4外表面構(gòu)建成PEG@Fe_3O_4-M17-Cy5的雙模態(tài)分子探針。細(xì)胞免疫熒光及磁共振掃描驗(yàn)證該探針可以特異性的對胰腺癌細(xì)胞系MIA PaCa-2與PANC-1進(jìn)行熒光顯像并能明顯降低細(xì)胞的T2WI信號(hào);通過對荷瘤裸鼠的熒光成像發(fā)現(xiàn)該探針可以在活體水平實(shí)現(xiàn)對PANC-1細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的靶向性熒光成像。結(jié)論:1.通過細(xì)胞SELEX技術(shù)篩選的適配體可以特異性識(shí)別MMP14蛋白高表達(dá)的細(xì)胞系,并能特異性結(jié)合胰腺癌MIA PaCa-2與PANC-1細(xì)胞系。該適配體有望作為一種親和組件構(gòu)建分子探針,實(shí)現(xiàn)對MMP14蛋白高表達(dá)的腫瘤的早期診斷及靶向治療。2.以M17為親和組件構(gòu)建的PEG@Fe_3O_4-M17-Cy5的雙模態(tài)分子探針可以實(shí)現(xiàn)對胰腺癌MIA PaCa-2與PANC-1細(xì)胞的熒光染色,并能有效降低兩種細(xì)胞的T2WI信號(hào)強(qiáng)度,實(shí)現(xiàn)對裸鼠MIA PaCa-2細(xì)胞皮下移植瘤的靶向熒光成像。該探針在胰腺癌及其他MMP14蛋白高表達(dá)腫瘤的靶向診斷上有一定的應(yīng)用潛力。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R445.2;R735.9
【部分圖文】：

空軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文進(jìn)行擴(kuò)增，得到標(biāo)記 FITC 的次級文庫，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測文庫的富集程）克隆測序：通過流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測到文庫中特異性識(shí)核酸序列足夠豐富時(shí)選，通過克隆測序獲得候選適配體，然后對這些候選對象進(jìn)行化學(xué)合成合力和特異性的鑒定。細(xì)胞 SELEX 篩選的時(shí)間一般在三個(gè)月左右。EX 篩選示意圖[137]如下：

空軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文序列中酶切位點(diǎn)，起始密碼子、終止密碼子位置是否合理；上序列送奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行基因合成。載體的準(zhǔn)備選擇實(shí)驗(yàn)室保存的 pCDH-CMV-MCS–EF1-Puro(CD510B-1)，酶切位點(diǎn)包括 5’-XbaⅠ-NheⅠ-EcoRⅠ-BstBⅠ-SwaⅠ-BamHⅠ 5’-XbaⅠ-NheⅠ- BamHⅠ-AgeⅠ-EcoRⅠ-EcoR Ⅴ-XhoⅠ-S’。選用的酶切位點(diǎn)為 NheⅠ和 EcoRⅠ。pCDH-CMV-MCS–EF1下：

08段部分測序結(jié)果
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本文編號(hào)：2856904