發(fā)布時間：2020-10-26 10:56

　　 目的:1.構(gòu)建特異性高表達MMP14蛋白的轉(zhuǎn)染細胞系,并利用該細胞系通過細胞SELEX技術(shù)篩選特異性識別MMP14蛋白的適配體;2.利用篩選的特異性適配體構(gòu)建磁共振和熒光的雙功能分子探針并檢測其成像效果。方法:1.通過基因合成方法構(gòu)建MMP14基因的慢病毒載體,并通過該載體轉(zhuǎn)染293T細胞構(gòu)建特異性高表達MMP14蛋白的293T-MMP14細胞。2.通過化學(xué)合成的方法構(gòu)建一個ssDNA文庫,其中心為40個堿基的隨機序列,前后均為固定的引物序列。通過細胞SELEX技術(shù),以轉(zhuǎn)染后的293T-MMP14細胞為正篩細胞,以MMP14蛋白陰性表達的293T-Plasmid細胞為負篩細胞篩選MMP14蛋白特異性適配體,經(jīng)過12輪篩選后對篩選文庫進行PCR擴增、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、單克隆挑選及測序獲得適配體候選對象,通過流式細胞術(shù)驗證候選對象與293T-MMP14細胞的親和力;選擇親和力最高的適配體,通過流式細胞術(shù)測試Kd值用以評估其結(jié)合特異性;通過細胞免疫熒光與流式細胞術(shù)測試適配體與胰腺癌細胞系的結(jié)合能力。3.以篩選的適配體為親和組件,通過化學(xué)合成的方法在其5’端標記Cy5,3’端標記氨基,再與磷脂-羧基聚乙二醇修飾的磁性Fe_3O_4納米顆粒(末端標記羧基)PEG@Fe_3O_4通過氨基羧基的縮合反應(yīng)連接,構(gòu)建標記熒光素Cy5與磁共振對比劑Fe_3O_4的雙模態(tài)分子探針。通過細胞免疫熒光及荷瘤裸鼠模型檢測其熒光成像功能,通過磁共振掃描檢測其在細胞層面的磁共振對比成像功能。結(jié)果:1.MMP14基因慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染293T細胞,建立特異性高表達MMP14蛋白的293T-MMP14細胞。2.經(jīng)過12輪篩選共獲得24個有效適配體序列,通過流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)M17適配體與293T-MMP14細胞親和力最高,其Kd值為4.98±1.26nM,處于nmol級別;通過細胞免疫熒光發(fā)現(xiàn)其可特異性結(jié)合在293T-MMP14細胞膜表面;流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)M17可特異性結(jié)合胰腺癌細胞系MIA PaCa-2與PANC-1。3.以PEG修飾的磁性納米顆粒(末端標記羧基)PEG@Fe_3O_4為核心,通過氨基羧基縮合反應(yīng)將5’端標記Cy5,3’端標記氨基的Cy5-M17-氨基適配體偶聯(lián)至PEG@Fe_3O_4外表面構(gòu)建成PEG@Fe_3O_4-M17-Cy5的雙模態(tài)分子探針。細胞免疫熒光及磁共振掃描驗證該探針可以特異性的對胰腺癌細胞系MIA PaCa-2與PANC-1進行熒光顯像并能明顯降低細胞的T2WI信號;通過對荷瘤裸鼠的熒光成像發(fā)現(xiàn)該探針可以在活體水平實現(xiàn)對PANC-1細胞裸鼠皮下移植瘤的靶向性熒光成像。結(jié)論:1.通過細胞SELEX技術(shù)篩選的適配體可以特異性識別MMP14蛋白高表達的細胞系,并能特異性結(jié)合胰腺癌MIA PaCa-2與PANC-1細胞系。該適配體有望作為一種親和組件構(gòu)建分子探針,實現(xiàn)對MMP14蛋白高表達的腫瘤的早期診斷及靶向治療。2.以M17為親和組件構(gòu)建的PEG@Fe_3O_4-M17-Cy5的雙模態(tài)分子探針可以實現(xiàn)對胰腺癌MIA PaCa-2與PANC-1細胞的熒光染色,并能有效降低兩種細胞的T2WI信號強度,實現(xiàn)對裸鼠MIA PaCa-2細胞皮下移植瘤的靶向熒光成像。該探針在胰腺癌及其他MMP14蛋白高表達腫瘤的靶向診斷上有一定的應(yīng)用潛力。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R445.2;R735.9
【部分圖文】：

空軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文進行擴增，得到標記 FITC 的次級文庫，通過流式細胞術(shù)檢測文庫的富集程）克隆測序：通過流式細胞術(shù)監(jiān)測到文庫中特異性識核酸序列足夠豐富時選，通過克隆測序獲得候選適配體，然后對這些候選對象進行化學(xué)合成合力和特異性的鑒定。細胞 SELEX 篩選的時間一般在三個月左右。EX 篩選示意圖[137]如下：

空軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文序列中酶切位點，起始密碼子、終止密碼子位置是否合理；上序列送奧科鼎盛生物科技有限公司進行基因合成。載體的準備選擇實驗室保存的 pCDH-CMV-MCS–EF1-Puro(CD510B-1)，酶切位點包括 5’-XbaⅠ-NheⅠ-EcoRⅠ-BstBⅠ-SwaⅠ-BamHⅠ 5’-XbaⅠ-NheⅠ- BamHⅠ-AgeⅠ-EcoRⅠ-EcoR Ⅴ-XhoⅠ-S’。選用的酶切位點為 NheⅠ和 EcoRⅠ。pCDH-CMV-MCS–EF1下：

08段部分測序結(jié)果
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本文編號：2856904