基因治療已成為治療癌癥的研究熱點(diǎn)之一,主要用于預(yù)防及治療惡性腫瘤,它具有良好的精準(zhǔn)度和特異性,而且相對于其他治療方式副作用較小,安全性更高。基因治療的高效性主要體現(xiàn)在基因載體的基因轉(zhuǎn)移能力�；蜉d體可以將目的基因運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞內(nèi),在細(xì)胞內(nèi)釋放出目的基因從而發(fā)揮基因的特定效應(yīng)。非病毒載體作為常用的基因載體,具有安全性高,轉(zhuǎn)移的DNA大小不受限制,免疫原性低等優(yōu)點(diǎn),比病毒載體更利于基因傳遞。樹狀大分子具有高支化的球形結(jié)構(gòu),內(nèi)含空腔且有單分散性、較好的穩(wěn)定性、溶解性,是理想的基因傳遞載體。樹狀大分子表面修飾聚乙二醇(PEG)可降低細(xì)胞毒性、免疫原性,提高基因傳遞效率。此外,其表面修飾葉酸(FA)后具有體內(nèi)外靶向性。本課題的主要研究內(nèi)容是第五代樹狀大分子(G5.NH2)經(jīng)修飾后作為非病毒基因載體進(jìn)行基因傳遞。研究對象是Au DENPsm PEG(P1)和Au DENPs-PEG-FA(P2)。首先針對這兩種載體材料進(jìn)行理化特性的表征,主要有核磁分析、紫外分光光度計(jì)測定以及透射電子顯微鏡觀察。再經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)測定載體完全壓縮質(zhì)粒DNA的能力以確定適宜的氮磷比濃度。粒徑大小和電勢正負(fù)的測量初步研究載體與質(zhì)粒DNA形成的復(fù)合物能否順利地進(jìn)入He La細(xì)胞。載體壓縮質(zhì)粒DNA后可以采用綠色熒光蛋白表達(dá)檢測和熒光素酶的表達(dá)試驗(yàn)來研究載體攜帶質(zhì)粒DNA的基因轉(zhuǎn)染能力。為了確定細(xì)胞吞噬載體材料的效率,運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)來檢測其內(nèi)吞效率及細(xì)胞內(nèi)定位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在N/P為1:1,2.5:1和5:1時,載體P2的基因轉(zhuǎn)染和細(xì)胞吞噬效率比P1顯著提高。載體和質(zhì)粒DNA復(fù)合體的大小適中,電位在正常范圍內(nèi),從而有利于進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染和細(xì)胞吞噬。同時,載體在濃度很高時細(xì)胞活力仍能達(dá)到75%以上,表明載體的細(xì)胞毒性小,生物相容性好。FA修飾的載體P2在N/P為0.5時就可以完全壓縮質(zhì)粒DNA,同時在N/P為2.5時,此載體的基因轉(zhuǎn)染效率比沒有修飾FA的載體材料的基因轉(zhuǎn)染效率高很多,說明此載體P2不僅可以高效壓縮質(zhì)粒DNA,而且較未修飾FA的對照材料,其基因轉(zhuǎn)染效率和基因傳遞效率大幅提升,生物相容性也有了一定改善。更重要的是在免疫安全性方面,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄實(shí)時定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試驗(yàn)對細(xì)胞因子表達(dá)量檢測結(jié)果表明,載體和載體與質(zhì)粒DNA復(fù)合物進(jìn)入巨噬細(xì)胞中,不會引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng),表現(xiàn)出低免疫原性。相比較而言,載體和Cp G DNA復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞會引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng),說明載體負(fù)載Cp G DNA后并沒有消除Cp G DNA的高免疫原性。總之,載體不僅具有高效的基因轉(zhuǎn)染效率,而且細(xì)胞毒性和免疫原性均很低,該載體作為高效的基因轉(zhuǎn)染載體,在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用具有良好的發(fā)展?jié)摿Α?br> 【學(xué)位單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R450
【部分圖文】：

物載體可以應(yīng)用于基因傳遞和藥物運(yùn)輸，但他陽離子聚合物載體，成為理想的基因傳簡介是一類高度分支化的單分子聚合物，其形狀均能夠調(diào)節(jié)[18,19]。它是由一個多官能核心，整體形成一個大的空腔[20,21]。其中特定通道如圖 1-1）。此外，分子結(jié)構(gòu)均一性高，具有性，球形結(jié)構(gòu)表面有大量的外圍基團(tuán)，可特殊結(jié)構(gòu)適合運(yùn)載藥物分子，也可用于基因樹狀大分子也可以用于某些抗癌藥物運(yùn)輸，負(fù)載所需疏水藥物，另一種途徑是在主要方與水溶性藥物進(jìn)行共價連接，其藥物傳遞系入體內(nèi)。

圖 1-2 Th1 型細(xì)胞免疫應(yīng)答和 Th2 型體液免疫應(yīng)答一般來說，機(jī)體的免疫應(yīng)答可以劃分為 Th1 型細(xì)胞免疫應(yīng)疫應(yīng)答兩種（如圖 1-2），Th1 型免疫應(yīng)答過程中分泌細(xì)胞因子活巨噬細(xì)胞，誘發(fā) IV 型變態(tài)反應(yīng)；Th2 型免疫應(yīng)答分泌細(xì)胞 IL-10，誘發(fā)產(chǎn)生特異性抗體。免疫應(yīng)答作用應(yīng)用于消滅腫瘤十分重要的作用。CD8+殺傷性 T 細(xì)胞可以用于攻擊腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞的效果。CTL 攻擊腫瘤細(xì)胞過程中，分為三個階段（抗原識別階段，T 淋巴細(xì)胞表面受體特異性識別腫瘤抗原，T原呈遞細(xì)胞表面的抗原肽-主要組織相容性復(fù)合物特異性結(jié)合給 CTL 細(xì)胞識別。然后是 T 細(xì)胞被活化、T 細(xì)胞增殖與分化識別后迅速被活化，從而表達(dá)出大量的不同類型細(xì)胞因子及相胞會逐漸增殖分化成具有腫瘤特異性的 T 細(xì)胞。最后是效應(yīng)階段，效應(yīng) CTL 細(xì)胞識別腫瘤靶細(xì)胞，經(jīng)活化釋放胞內(nèi)顆粒細(xì)胞的細(xì)胞膜穿孔，釋放顆粒酶促進(jìn)靶細(xì)胞凋亡[62,63]。除此之經(jīng)活化后，跨膜蛋白 FasL 高度表達(dá)，然后啟動凋亡信號的轉(zhuǎn)

種（如圖 1-2），Th1 型免疫應(yīng)答過程中分泌細(xì)胞因子 IFN-γ、IL胞，誘發(fā) IV 型變態(tài)反應(yīng)；Th2 型免疫應(yīng)答分泌細(xì)胞因子 IL-誘發(fā)產(chǎn)生特異性抗體。免疫應(yīng)答作用應(yīng)用于消滅腫瘤細(xì)胞的過的作用。CD8+殺傷性 T 細(xì)胞可以用于攻擊腫瘤細(xì)胞，達(dá)到識的效果。CTL 攻擊腫瘤細(xì)胞過程中，分為三個階段（如圖 1-3階段，T 淋巴細(xì)胞表面受體特異性識別腫瘤抗原，T 細(xì)胞抗原胞表面的抗原肽-主要組織相容性復(fù)合物特異性結(jié)合形成復(fù)合細(xì)胞識別。然后是 T 細(xì)胞被活化、T 細(xì)胞增殖與分化階段，T速被活化，從而表達(dá)出大量的不同類型細(xì)胞因子及相應(yīng)的受體增殖分化成具有腫瘤特異性的 T 細(xì)胞。最后是效應(yīng) T 細(xì)胞產(chǎn)應(yīng) CTL 細(xì)胞識別腫瘤靶細(xì)胞，經(jīng)活化釋放胞內(nèi)顆粒，釋放穿胞膜穿孔，釋放顆粒酶促進(jìn)靶細(xì)胞凋亡[62,63]。除此之外，效應(yīng)，跨膜蛋白 FasL 高度表達(dá)，然后啟動凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而引瘤小鼠體內(nèi)輸入被腫瘤抗原激活的 T 細(xì)胞，可引起荷瘤小鼠產(chǎn)答，這是抗腫瘤治療的有效手段之一。
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本文編號：2854838