目的:研究艱難梭菌感染實(shí)驗(yàn)室診斷方法。研究北京市艱難梭菌分子流行病學(xué)特征、抗菌藥物敏感性及耐藥機(jī)制。研究北京市主要流行菌株毒力差異。方法:本研究納入北京協(xié)和醫(yī)院、北京朝陽醫(yī)院、航天中心醫(yī)院及煤炭總醫(yī)院收集的804份糞便標(biāo)本及348株產(chǎn)毒素艱難梭菌。實(shí)驗(yàn)室診斷方面,基于培養(yǎng)方法,評估艱難梭菌鑒定培養(yǎng)基(Chrome ID C.difficile agar,CDIF)對艱難梭菌的分離、鑒定能力,及谷氨酸脫氫酶試驗(yàn)(glutamate dehydrogenase,GDH)的敏感性和特異性;基于產(chǎn)毒素培養(yǎng)的方法,評估艱難梭菌毒素A/B試驗(yàn)(Clostridium diffcile toxins A/B,CDAB)、GeneXpert試驗(yàn)的敏感性和特異性。分子流行病學(xué)方面,對348株產(chǎn)毒素艱難梭菌進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing,MLST)及核糖體分型,以瓊脂稀釋法檢測艱難梭菌對11種抗菌藥物的體外敏感性,并檢測GyrA、GryB及RpoB的氨基酸變異,研究喹諾酮類、利福平耐藥表型與基因型的關(guān)系。毒力研究方面,選取代表性菌株,在mRNA、毒素蛋白、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)及動物實(shí)驗(yàn)四個(gè)層面研究北京市主要流行菌株的毒力差異。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)室診斷方面,CDIF培養(yǎng)基具有快速、操作簡便等特點(diǎn),且可準(zhǔn)確鑒定艱難梭菌。GDH試驗(yàn)具有較高的敏感性(100%)和特異性(92.8%),陽性結(jié)果表明標(biāo)本中存在艱難梭菌,但不能確證菌株是否產(chǎn)毒素。CDAB試驗(yàn)直接檢測糞便標(biāo)本中的毒素,敏感性較低(47.5%),特異性較高(96.4%),不推薦單獨(dú)用于艱難梭菌感染(Clostridium diffcileinfection,CDI)的診斷。GeneXpert 試驗(yàn)可快速檢測糞便標(biāo)本中的毒素基因,具有較高的敏感性(99%)和特異性(89.7%),但成本較高。推薦使用兩步法或三步法檢測流程診斷CDI。在分子流行病學(xué)方面,本研究報(bào)道了 3例ST1/RT027型高毒力菌株,其中2例為中國北方的首次報(bào)道,第3例引起重度CDI。北京市主要流行的型別為ST81/PU09、ST37/RT017、ST3/RT001和ST54/RT012四種型別。首次發(fā)現(xiàn)并命名了 8個(gè)MLST型別:ST382、ST383、ST384、ST385、ST410、ST411、ST413 和 ST414。不同醫(yī)院間流行菌株的分子型別差異較大,北京朝陽醫(yī)院70%的菌株為ST81/PU09型艱難梭菌。本研究通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(Matrix-AssistedLaser Desorption/Ionization Time of Flight Mass,MALDI-TOF MS)首次發(fā)現(xiàn) 2691.43 Da、2704.91 Da、2711.93 Da、3247.27、3290.76 Da 五個(gè)特征峰可準(zhǔn)確、快速地鑒別 MLST clade 4集群艱難梭菌,該集群主要包括高度耐藥的ST81/PU09型和ST37/RT017型菌株。抗菌藥物敏感性研究方面,348株艱難梭菌對甲硝唑、萬古霉素、美羅培南、哌拉西林-他唑巴坦均敏感,但對克林霉素(93.1%)、紅霉素(69.5%)、四環(huán)素(42.5%)、環(huán)丙沙星(88.8%)、左氧氟沙星(47.4%)和莫西沙星(40.2%)的耐藥率較高,對利福平的耐藥率為8.3%。不同型別菌株耐藥率差異較大,ST81/PU09型和ST37/RT017型菌株耐藥率最高,利福平耐藥的菌株主要集中于ST37/RT017型。GyrA、GyrB和RpoB變異是喹諾酮類和利福平耐藥的主要機(jī)制,不同型別菌株攜帶耐藥基因突變類型和比例差異較大,其中ST81/PU09型和ST37/RT017型菌株攜帶耐藥基因突變率最高。在毒力研究方面,ST1/RT027型菌株在毒素蛋白表達(dá)量、細(xì)胞毒力及動物毒力三個(gè)層面表現(xiàn)出最強(qiáng)毒力,其次為ST3/RT001型菌株,而ST54/RT012型、ST37/]RT017型和ST81/PU09型菌株毒力較弱。ST3/RT001型和ST54/RT012型菌株tcdA、tcdC基因相對表達(dá)量顯著高于ST37/RT017型和ST81/PU09型菌株;ST3/RT001型和ST54/RT012型菌株tcdB基因相對表達(dá)量顯著低于ST37/RT017型和ST81/PU09型菌株。結(jié)論:現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室診斷方法各有特點(diǎn),推薦國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室使用多種方法聯(lián)合診斷CDI。北京市已出現(xiàn)ST1/RT027型高毒力艱難梭菌,需加強(qiáng)監(jiān)測,防止該型菌株暴發(fā)流行。北京市主要流行的ST81/PU09型和ST37/RT017型艱難梭菌具有高度耐藥、低毒力的特點(diǎn)。本研究對提高CDI實(shí)驗(yàn)室診斷能力,掌握北京市艱難梭菌分子流行病學(xué)特征、耐藥性及毒力狀況提供重要數(shù)據(jù)支撐和參考依據(jù)。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R446.5
【部分圖文】：

１．１．?ＣＤＩＦ和ＣＣＦＡ培養(yǎng)基菌落特點(diǎn)的比較??艱難梭菌在ＣＣＦＡ培養(yǎng)基上具有淡黃色、扁平、粗糙、“油煎蛋”樣菌落，在ＣＤＩＦ??培養(yǎng)基上的菌落具有黑色、扁平、粗糙、邊緣不整的特點(diǎn)，見圖１．１。ＣＣＦＡ培養(yǎng)基??培養(yǎng)時(shí)間至少４８?ｈ，而ＣＤＩＦ培養(yǎng)基可在２４?ｈ分離鑒定艱難梭菌。??鶴？著丨??圖１．１?ＣＤＩＦ和ＣＣＦＡ培養(yǎng)基上艱難梭菌菌落特征??注．？艱難梭菌在ＣＣＦＡ培養(yǎng)基上生長４８?ｈ后的菌落（左），艱難梭菌在ＣＤＩＦ培養(yǎng)基上生長２４?ｈ??后的菌落（又）??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｔｈｅ?ｃｏｌｏｎｙ?ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ?ｏｆ?Ｃ．?ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ?ｏｎ?ＣＤＩＦ?ａｎｄ?ＣＣＦＡ?ａｇａｒ??Ｎｏｔｅ：?Ｔｈｅ?ｃｏｌｏｎｙ?ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ?ｏｆ?Ｃ．?ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ?ｉｓｏｌａｔｅｓ?ｏｎ?ＣＣＦＡ?ａｇａｒ?ａｆｔｅｒ?４８?ｈ?ｃｕｌｔｕｒｅ?（ｌｅｆｔ）．?Ｔｈｅ??ｃｏｌｏｎｙ?ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ?ｏｆ?Ｃ．?ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ?ｉｓｏｌａｔｅｓ?ｏｎ?ＣＤＩＦ?ａｇａｒ?ａｆｔｅｒ?２４?ｈ?ｃｕｌｔｕｒｅ?（ｒｉｇｈｔ）．??１．２．?ＣＤＩＦ和ＣＣＦＡ培養(yǎng)基對艱難梭菌的分離能力??２５５份標(biāo)本中，共分離出６２株艱難梭菌。ＣＤＩＦ和ＣＣＦＡ培養(yǎng)基各分離出６１??株艱難梭菌，一致率達(dá)９９．２％（２３３／２５５）。其中，ＣＤＩＦ培養(yǎng)基上４９份（８０．３％，?４９／６１）??標(biāo)本為形態(tài)單一菌落，ＣＣＦＡ培養(yǎng)基上４７份（７７．０％，４７／６１）標(biāo)本為形態(tài)單一菌落，??二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（／＝〇．〇４８９

ｉ?＾?Ｉ?－１００?ｂｐ??圖１．２?５重ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖??注：１號菌株有／ａ／ｄ、／Ｃ６？、Ｃ（Ａ４、ｃ＜ｉ／５四個(gè)基因；２－６、８－１２號菌株有／Ｃｄｉ４、ｔｏ／５基因；７??號菌株不含毒素基因；Ｍ為１００?ｂｐ?ｍａｒｋｅｒ??Ｆｉｇｕｒｅ?１．２?Ｔｈｅ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ?ｏｆ?ｔｈｅ?５－ｐｌｅｘ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ??Ｎｏｔｅ：?Ｔｈｅ?ｎｕｍｂｅｒ?１?ｓｔｒａｉｎ?ｃｏｎｔａｉｎｓ?ｔｃｄＡ，?ｔｃｄＢ，?ｃｄｔＡ?ａｎｄ?ｃｄｔＢ?ｇｅｎｅｓ．?Ｔｈｅ?ｎｕｍｂｅｒ?２－６?ａｎｄ?８－１２?ｓｔｒａｉｎｓ??ｃｏｎｔａｉｎ?ｔｃｄＡ?ａｎｄ?ｔｃｄＢ?ｇｅｎｅｓ．?Ｔｈｅ?ｎｕｍｂｅｒ?７?ｓｔｒａｉｎ?ｈａｓ?ｎｏ?ｔｏｘｉｎ?ｇｅｎｅ．?Ｍ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ?１００?ｂｐ?ｍａｒｋｅｒ．??２．２．２．基因缺失的判定??ａ－ｅ、ｈ－ｋ菌株條帶為１２００?ｂｐ，無缺失；ｆ、ｇ菌株條帶為７００?ｂｐ，有??缺失，如圖?１．３。??２０００?ｂｐ?－?■?；?Ｌ?＂?＾?丨丨?．［ｊ??１０００?ｂｐ?－?＾Ｈｒ?興??７５０?ｂｐ?－??ｂｐ?－??２５０?ｂｐ?－?■?１?ｉｊ??圖１．３?基因ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖??注：Ｍ為２Ｋｍａｒｋｅｒ，ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ無於缺失；ｆ、ｇ有缺失；ｍ為陰性對照??Ｆｉｇｕｒｅ?１．３?Ｔｈｅ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｔｃｄＡ?ｇｅｎｅ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ??Ｎｏｔｅ：?Ｍ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ?２Ｋ?ｍａｒｋｅｒ．?Ｓｔｒａｉｎｓ?ａ

２５０?ｂｐ?－?■?１?ｉｊ??圖１．３?基因ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖??注：Ｍ為２Ｋｍａｒｋｅｒ，ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ無於缺失；ｆ、ｇ有缺失；ｍ為陰性對照??Ｆｉｇｕｒｅ?１．３?Ｔｈｅ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｔｃｄＡ?ｇｅｎｅ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ??Ｎｏｔｅ：?Ｍ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ?２Ｋ?ｍａｒｋｅｒ．?Ｓｔｒａｉｎｓ?ａ，?ｂ，?ｃ，?ｄ，?ｅ，?ｈ，?ｉ，?ｊ，?ｋ?ｈａｖｅ?ｎｏ?ｔｃｄＡ?ｇｅｎｅ?ｄｅｌｅｔｉｏｎ．?Ｓｔｒａｉｎｓ?ｆ?ａｎｄ?ｇ??ｈａｖｅ?ｔｃｄＡ?ｇｅｎｅ?ｄｅｌｅｔｉｏｎ，?ｍ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ．??２０??
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 程敬偉;徐志鵬;孫林英;侯欣;徐英春;趙玉沛;;難辨梭菌鑒定培養(yǎng)基臨床應(yīng)用評估[J];臨床檢驗(yàn)雜志;2015年07期

本文編號：2839615