發(fā)布時間：2020-10-13 19:18

【摘要】：急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease,aGVHD)目前仍然為異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)后最嚴(yán)重、富有挑戰(zhàn)性的并發(fā)癥之一,allo-HSCT后aGVHD發(fā)病率約為40-60%,主要累及皮膚、胃腸道及肝臟。其中,腸道aGVHD目前風(fēng)險高且仍較難治愈,成為allo-HSCT后死亡的重要原因之一,然而,受限于取材困難、區(qū)域性關(guān)注度少等因素,aGVHD發(fā)生發(fā)展過程中腸道區(qū)域免疫細(xì)胞的動態(tài)變化及相互作用仍不明確。本研究中我們建立了成熟穩(wěn)定的小鼠異基因骨髓移植及aGVHD模型,利用腸道黏膜單細(xì)胞分離技術(shù),檢測了移植后aGVHD小鼠腸道黏膜固有層中T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、髓系來源的抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)、樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)、固有免疫細(xì)胞(innate lymphoid cells,ILC)等數(shù)量變化規(guī)律及其與aGVHD關(guān)系;分析腸道黏膜屏障中重要細(xì)胞因子IL-17A、IL-22的變化及其分泌細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)分泌IL-17的γδT(γδT17)細(xì)胞為腸道黏膜固有層IL-17A及IL-22的主要來源;利用單細(xì)胞qPCR技術(shù)對骨髓移植小鼠腸道黏膜γδT17細(xì)胞生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定,篩選出γδT17細(xì)胞在腸道中發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能的可能作用機(jī)制;最后,本研究建立體外誘導(dǎo)IL-22+γδT17細(xì)胞培養(yǎng)體系,發(fā)現(xiàn)腸道γδT17細(xì)胞為aGVHD中發(fā)揮腸道保護(hù)作用的關(guān)鍵細(xì)胞亞群,并對其調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行深入探討。本研究對于揭示aGVHD中腸道區(qū)域免疫特性、發(fā)現(xiàn)潛在預(yù)防新策略及治療新靶點(diǎn)具有重要的理論和實際意義。第1章 骨髓移植后小鼠腸道細(xì)胞亞群研究目的:目前aGVHD發(fā)生發(fā)展過程中腸道黏膜固有層各種免疫細(xì)胞組成、來源及變化尚無較為全面的報道。本部分就骨髓移植后小鼠腸道黏膜固有層細(xì)胞亞群進(jìn)行研究,探索無aGVHD及aGVHD小鼠T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、MDSC、巨噬細(xì)胞、DC等常見免疫細(xì)胞來源及其變化規(guī)律。方法:我們以Balb/c背景小鼠為受者,以C57/B6背景小鼠為供者建立穩(wěn)定的小鼠骨髓移植aGVHD模型;于移植后第二周從無aGVHD組小鼠及aGVHD組小鼠中隨機(jī)選取小鼠,取其腸道觀察其損傷狀態(tài),利用膠原酶、EDTA、DNA酶等混合而成的消化液將腸道黏膜分離為單個細(xì)胞,并利用不同濃度的percoll液將細(xì)胞過濾。隨后利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞種類、數(shù)量及來源等生物學(xué)特性。結(jié)果:建立穩(wěn)定的小鼠骨髓移植aGVHD模型后,我們觀察到小鼠體重下降、弓背、腹瀉及頭面部、背部脫毛等aGVHD癥狀。解剖后發(fā)現(xiàn)小腸腸腔變細(xì),腸壁紅色且較薄,腸腔內(nèi)多處深色稀水樣大便殘留等。腸道黏膜固有層CD3+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞、NK細(xì)胞、MDSC、巨噬細(xì)胞、DC大部分均表達(dá)供者小鼠C57/B6特異性蛋白H2kb。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),無aGVHD小鼠腸道黏膜固有層B細(xì)胞數(shù)量相對最多,其次為NK細(xì)胞、MDSC、DC、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞;而aGVHD小鼠T細(xì)胞數(shù)量相對最多,其次為NK細(xì)胞、MDSC、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞。同一種細(xì)胞進(jìn)行兩組比較分析,aGVHD小鼠T細(xì)胞多于無aGVHD小鼠,而B細(xì)胞、NK細(xì)胞、MDSC及DC少于無aGVHD小鼠,巨噬細(xì)胞在兩組中無顯著性差異。結(jié)論:骨髓移植后小鼠腸道黏膜固有層免疫細(xì)胞大部分為供者來源,aGVHD發(fā)生時T細(xì)胞明顯擴(kuò)增,具有免疫抑制功能的MDSC明顯數(shù)量受損。第2章 骨髄移植后小鼠腸道IL-17、IL-22變化及其分泌細(xì)胞研究目的:細(xì)胞因子在aGVHD的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用,其中IL-17與IL-22均為具有復(fù)雜作用的重要細(xì)胞因子。目前小鼠骨髓移植模型中腸道黏膜IL-17、IL-22分泌來源仍不清楚,因此本章節(jié)將對腸道IL-17、IL-22分泌細(xì)胞及其數(shù)量等相關(guān)生物學(xué)特性進(jìn)行研究。方法:建立小鼠異基因骨髓移植模型后,于移植后第二周從無aGVHD組小鼠及aGVHD組小鼠中隨機(jī)選取小鼠,取腸道黏膜固有層細(xì)胞進(jìn)行多色流式檢測,分析統(tǒng)計細(xì)胞IL-17與IL-22分泌細(xì)胞種類及比例。結(jié)果:骨髓移植后小鼠腸道黏膜固有層免疫細(xì)胞IL-17分泌能力無顯著性差異,aGVHD組小鼠IL-22分泌能力低于無aGVHD組。兩組腸道IL-17A、IL-22主要來源于供者γδT細(xì)胞,aGVHD組小鼠腸道中γδT17細(xì)胞占供者細(xì)胞比例顯著低于無aGVHD組,aGVHD組IL-22+γδT17細(xì)胞也同樣低于無aGVHD組。結(jié)論:γδT細(xì)胞為骨髓移植后腸道黏膜IL-17、IL-22的主要分泌來源,分泌IL-22的γδT17細(xì)胞可能是腸道aGVHD中發(fā)揮保護(hù)作用的關(guān)鍵細(xì)胞亞群,但具體作用和機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究和闡明。第3章γδT17細(xì)胞在腸道aGVHD中的生物學(xué)特性及作用機(jī)制研究目的:γδT細(xì)胞是一類廣泛分布于皮膚腸道等黏膜組織的非MHC限制性固有免疫細(xì)胞,被稱為適應(yīng)性免疫和固有免疫的橋梁。γδT細(xì)胞的不同亞群在aGVHD的病理過程中可能發(fā)揮著致病或者保護(hù)的不同作用。然而,小鼠aGVHD中腸道γδT17細(xì)胞的生物學(xué)特性及其與MDSC等免疫細(xì)胞及IEC等基質(zhì)細(xì)胞之間的作用機(jī)制尚無報道。方法:首先取移植后無aGVHD組及aGVHD組小鼠腸道,將兩組小腸進(jìn)行免疫熒光染色及拍攝。我們進(jìn)一步取野生型供者C57/B6小鼠、移植后無aGVHD小鼠、aGVHD小鼠腸道單細(xì)胞,染色后利用分選CD45+CD3+γδTCR+細(xì)胞,分選后的細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞qPCR檢測,篩選其表型與功能。利用IL-1β+IL-23聯(lián)合全反式維甲酸方案誘導(dǎo)脾臟細(xì)胞,檢測γδT細(xì)胞IL-17、IL-22分泌能力,利用最優(yōu)誘導(dǎo)方案建立aGVHD模型。結(jié)果:小腸免疫熒光提示γδTCR與IL-17A在腸道黏膜固有層處存在共定位。單細(xì)胞qPCR結(jié)果顯示移植后小鼠γδT17細(xì)胞高表達(dá)il17a、il17f、il8、csf2、IL23R,Il17ra、Il17rc、Ocln等基因,IL-22+γδT17 比 IL-22-γδT17 高表達(dá)Il23r、Id2、Steap4、Tlr1、ccr9等基因。在aGVHD發(fā)生時,γδT17細(xì)胞notch2、csf2、il22基因表達(dá)均低于無 aGVHD 組。1Ong/ml IL-1 與 1Ong/ml IL-23 與 1μm RA 培養(yǎng)體系 IL-22+γδT17細(xì)胞誘導(dǎo)效率最高。IL-22+γδT17細(xì)胞升高可減輕aGVHD嚴(yán)重程度及降低aGVHD死亡率。結(jié)論:γδT17細(xì)胞存在于骨髓移植后小鼠腸道黏膜固有層,IL-22+γδT17細(xì)胞可能為腸道中發(fā)揮保護(hù)作用的關(guān)鍵細(xì)胞亞群,其可能通過分泌細(xì)胞因子促進(jìn)腸道上皮修復(fù)、支持腸道緊密連接、招募MDSC抑制免疫反應(yīng),Il23r、Id2、Steap4、Tlr1、ccr9、notch2可能為參與γδT17細(xì)胞IL-22等細(xì)胞因子表達(dá)調(diào)控的調(diào)節(jié)因子。IL-22+γδT17細(xì)胞在aGVHD過程中具有重要的保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R457.7
【圖文】：

１．４．１建立穩(wěn)定的小鼠骨髓移植后ａＧＶＨＤ模型??我們以Ｂａｌｂ／ｃ背景小鼠為受者進(jìn)行Ｘ線清髓性輻照后，以Ｃ５７／Ｂ６背景小鼠??為供者，根據(jù)體重隨機(jī)分組后進(jìn)行骨髓移植，建立ａＧＶＨＤ模型（圖１．１?Ａ），模??型建立后逐漸顯現(xiàn)ａＧＶＨＤ相關(guān)癥狀。由于輻照，第二天開始無ａＧＶＨＤ組??（ｎｏｎ－ａＧＶＨＤ）及ａＧＶＨＤ組小鼠均體重下降，１周后由于造血逐漸恢復(fù)兩組小鼠??體重均有所回升，２周后，無ａＧＶＨＤ小鼠體重穩(wěn)步回升，而ａＧＶＨＤ組小鼠由于??ａＧＶＨＤ癥狀逐漸顯現(xiàn)而體重進(jìn)行性下降（圖１．１?Ｅ）。造模后２周ａＧＶＨＤ組小鼠??逐漸出現(xiàn)頭面部、背部脫毛現(xiàn)象，并且出現(xiàn)弓背及腹瀉，因此體型較無ａＧＶＨＤ組??瘦�。▓D１．１Ｂ）。為觀察腸道損傷狀態(tài)，移植后２周取兩組小鼠，從腹部正中線??將其解剖，取回盲部至闌尾中間部分小腸，浸泡于０．９％生理鹽水中，無ａＧＶＨＤ??小鼠小腸可觀察到腸壁光滑無出血、破潰，腸腔較粗，較少稀水樣大便，而ａＧＶＨＤ??小鼠小腸腸腔變細(xì)

發(fā)現(xiàn)腸道黏膜固有層ＣＤ３＋Ｔ細(xì)胞超過９０°／。均表達(dá)供者小鼠Ｃ５７／Ｂ６特異性蛋白??Ｈ２ｋｂ?（９２．８±１．８％?ｖｓ?９８．０３±１．８％，ｐ＝０．０２４３?），表明移植后２周時兩組小鼠腸道黏??膜固有層ＣＤ３＋Ｔ細(xì)胞基本全部來自供者。（圖１．２）利用相似方法檢測ＣＤ１９＋Ｂ??細(xì)胞，骨髓移植后無ａＧＶＨＤ小鼠腸道黏膜固有層ＣＤ１９＋Ｂ細(xì)胞幾乎全部來自供者??（９６．２±０．３％），ａＧＶＨＤ小鼠腸道黏膜固有層ＣＤ１９＋Ｂ細(xì)胞大部分來源于供者??（７４．２±３．３°／。，ｐ＝０．０００３?），其比例少于無?ａＧＶＨＤ?組。（圖?１?＿３?）根據(jù)?ＣＤ５?表達(dá)??情況將Ｂ細(xì)胞細(xì)分為Ｂ１型（ＣＤ５＋ＣＤ１９＋）、Ｂ２型（ＣＤ５ＴＤ１９＋）細(xì)胞分析時，??我們發(fā)現(xiàn)骨髓移植后無ａＧＶＨＤ小鼠腸道黏膜固有層以Ｂ２細(xì)胞（４３．６±１２．１％）為??主，ａＧＶＨＤ小鼠以Ｂ１細(xì)胞（８２．３±１０．６％）為主，發(fā)生ａＧＶＨＤ時Ｂ１細(xì)胞占Ｂ細(xì)??胞比例明顯多于無?ａＧＶＨＤ?組（８２．３±１０．６％ｖｓ?１５．９±１０．６％，ｐ＝０．００１５?），而?Ｂ２?細(xì)??胞在有無３〇￥１１〇兩組中無顯著性差異（５３．８士１２．３％丫３?４３．６±１２．１％，？＝０．３６３６）。??（圖?１＿４）??Ａ?１?Ｂ?．．?１?Ｃ?移植后腸道黏膜Ｔ細(xì)胞來源??１〇＊

發(fā)現(xiàn)腸道黏膜固有層ＣＤ３＋Ｔ細(xì)胞超過９０°／。均表達(dá)供者小鼠Ｃ５７／Ｂ６特異性蛋白??Ｈ２ｋｂ?（９２．８±１．８％?ｖｓ?９８．０３±１．８％，ｐ＝０．０２４３?），表明移植后２周時兩組小鼠腸道黏??膜固有層ＣＤ３＋Ｔ細(xì)胞基本全部來自供者。（圖１．２）利用相似方法檢測ＣＤ１９＋Ｂ??細(xì)胞，骨髓移植后無ａＧＶＨＤ小鼠腸道黏膜固有層ＣＤ１９＋Ｂ細(xì)胞幾乎全部來自供者??（９６．２±０．３％），ａＧＶＨＤ小鼠腸道黏膜固有層ＣＤ１９＋Ｂ細(xì)胞大部分來源于供者??（７４．２±３．３°／。，ｐ＝０．０００３?），其比例少于無?ａＧＶＨＤ?組。（圖?１?＿３?）根據(jù)?ＣＤ５?表達(dá)??情況將Ｂ細(xì)胞細(xì)分為Ｂ１型（ＣＤ５＋ＣＤ１９＋）、Ｂ２型（ＣＤ５ＴＤ１９＋）細(xì)胞分析時，??我們發(fā)現(xiàn)骨髓移植后無ａＧＶＨＤ小鼠腸道黏膜固有層以Ｂ２細(xì)胞（４３．６±１２．１％）為??主，ａＧＶＨＤ小鼠以Ｂ１細(xì)胞（８２．３±１０．６％）為主，發(fā)生ａＧＶＨＤ時Ｂ１細(xì)胞占Ｂ細(xì)??胞比例明顯多于無?ａＧＶＨＤ?組（８２．３±１０．６％ｖｓ?１５．９±１０．６％，ｐ＝０．００１５?），而?Ｂ２?細(xì)??胞在有無３〇￥１１〇兩組中無顯著性差異（５３．８士１２．３％丫３?４３．６±１２．１％，？＝０．３６３６）。??（圖?１＿４）??Ａ?１?Ｂ?．．?１?Ｃ?移植后腸道黏膜Ｔ細(xì)胞來源??１〇＊
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本文編號：2839595