目的:基因治療從基因的根源出發(fā),是將治療型基因藥物輸送到靶細胞或細胞中特定靶點從而來更改基因表達,以治療疾病的方法,由于高療效與低毒副的特點,可成為治療腫瘤等基因疾病的理想方法。但基因治療臨床受限于安全高效的基因載體。本研究目的在于設計一種安全高效的非病毒載體,搭載核酸藥物,構(gòu)建基因傳送系統(tǒng)用于治療結(jié)腸癌,為結(jié)腸癌的基因治療提供新的研究思路。方法:以生物相容性良好的小分子量聚乙烯亞胺(Polyethylenimine 5000,PEI_(5K))為骨架,通過異硫氰酸酯甘露糖苷(MPITC)的異硫氰酸酯基團與小分子量聚乙烯亞胺上的氨基反應,合成Man-PEI_(5K),繼而通過Man-PEI_(5K)上的氨基與低分子量魚精蛋白的巰基進行反應,合成載體材料Man-PEI_(5K) CPP。該載體具有較強的正電荷,可通過靜電作用搭載核酸藥物,形成基因傳遞系統(tǒng)Man-PEI_(5K) CPP/pDNA,采用馬爾文激光粒度儀測定該系統(tǒng)的粒徑及電位,并用透射電鏡(Transmission Electron Microscope,TEM)觀察該傳遞系統(tǒng)的形態(tài)。在基因系統(tǒng)的體外評價部分,首先進行細胞攝取實驗和腫瘤球穿透實驗考察腫瘤細胞對基因系統(tǒng)的攝取能力和該基因系統(tǒng)的穿透能力;通過細胞增殖抑制實驗考察載體材料本身的毒性和對腫瘤細胞的選擇性殺傷效果;通過Western Blot技術考察腫瘤細胞上治療基因的蛋白表達情況;通過細胞轉(zhuǎn)染實驗考察該載體的基因轉(zhuǎn)染效果。體內(nèi)評價部分,建立荷人源結(jié)腸癌移植瘤的裸鼠模型,采用體內(nèi)分布實驗考察基因系統(tǒng)在體內(nèi)的分布情況。通過藥效學實驗考察系統(tǒng)的抗腫瘤效果,并對基因傳遞系統(tǒng)的生物安全性作了評價。成果與結(jié)論:我們發(fā)現(xiàn)甘露糖受體(Mannose receptor,MR)除在巨噬細胞和肝臟部位表達外,在結(jié)腸癌細胞系HCT116也高表達,故本文的第二章以生物相容性良好的聚乙烯亞胺5000(Polyethylenimine 5000,PEI_(5K))為骨架,為了提高基因傳遞系統(tǒng)的靶向性與穿膜能力,我們在基因載體上修飾了甘露糖受體的配體甘露糖和穿膜肽。反應具體為:通過異硫氰酸酯甘露糖苷(α-D-Mannopyranosylphenyl isothiocyanate,MPITC)的異硫氰酸酯基團與PEI_(5K)上的氨基反應,合成Man-PEI_(5K),接著Man-PEI_(5K)上的剩余氨基與低分子量魚精蛋白(Low Molecular Weight Protamine,LMWP)的巰基進行反應,合成載體材料甘露糖-低分子量聚乙烯亞胺-穿膜肽(Man-PEI_(5K)-CPP)。并通過傅立葉紅外光譜和核磁共振氫譜對于該載體材料進行表征。構(gòu)建質(zhì)粒DNA,用Man-PEI_(5K)-CPP搭載pDNA,從而成功構(gòu)建一種新型的甘露糖及穿膜肽修飾的基因傳遞系統(tǒng)Man-PEI_(5K)-CPP/pDNA。這一系統(tǒng)為帶正電荷的均一分散的球形納米粒。我們以腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體基因(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)作為模型核酸藥物,構(gòu)建基因傳遞系統(tǒng)Man-PEI_(5K)-CPP/pTRAIL,這一體系可以誘導腫瘤細胞凋亡,但不會誘導正常細胞凋亡。PEI_(25K)是一個常用的非病毒載體,為基因轉(zhuǎn)染的“黃金標準”,然而其載體本身的毒性大,用人源胚胎腎細胞(human embryonic kidney 293T cells,HEK293T)先考察載體材料Man-PEI_(5K)-CPP自身的毒性,發(fā)現(xiàn)其自身毒性小于PEI_(25K)。而后以PEI_(25K)/pTRAIL作為陽性對照,通過細胞毒性實驗,細胞凋亡實驗以及Western Blot檢測Man-PEI_(5K)-CPP/pTRAIL的抗腫瘤效果,發(fā)現(xiàn)Man-PEI_(5K)-CPP/pTRAIL的體外抗腫瘤效果優(yōu)于PEI_(25K)/pTRAIL。采用YoYo-1標記質(zhì)粒DNA,通過細胞攝取和體外腫瘤球穿透實驗考察該基因傳遞系統(tǒng)的靶向和穿透效果。從上述實驗的結(jié)果發(fā)現(xiàn)Man-PEI_(5K)-CPP/pEGFP的轉(zhuǎn)染,攝取,腫瘤球穿透效果均優(yōu)于PEI_(25K)/pEGFP。采用增強綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)作為報告基因,發(fā)現(xiàn)雙修飾系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率最高。盡管體外實驗PEI_(25K)的轉(zhuǎn)染效率高,但其體內(nèi)效果卻差強人意。因此對于體外轉(zhuǎn)染效果良好的基因傳遞系統(tǒng)的相應體內(nèi)評價十分重要。本文建立了荷人源結(jié)腸癌移植瘤裸鼠模型,考察了Man-PEI_(5K)-CPP/pTRAIL的體內(nèi)分布情況和藥效,并對其體內(nèi)毒性進行了評價。體內(nèi)分布實驗結(jié)果表明,Man-PEI_(5K)-CPP/pTRAIL在體內(nèi)的循環(huán)時間和靶向腫瘤部位的效果優(yōu)于PEI_(25K)/pTRAIL。藥效實驗結(jié)果表明,Man-PEI_(5K)-CPP/pTRAIL具有良好的體內(nèi)抑瘤效果,且體內(nèi)毒性較小。綜上,我們構(gòu)建的Man-PEI_(5K)-CPP/pDNA具有良好的抑瘤效果,能為為結(jié)腸癌治療提供了一個新思路。
【學位單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R735.35;R450
【部分圖文】：

1.1 基因治療的概述1.1.1 基因治療的概念及發(fā)展1968 年基因治療的概念首次被提出，基因治療是從基因根源著手，將治療基因安全有效地輸送至靶細胞，抵消或糾正故障基因?qū)C體造成的不良影響，以治療疾病[18]。廣義上講，如反義核酸技術[19]和 DNA 疫苗[20]等與分子生物學相關的方法也可視為基因治療。1989 年美國批準了世界首個關于基因治療的臨床方案[18]。1990 年世界上第一個真正意義上的基因治療的臨床試驗展開[21]。2000 年，法國巴黎內(nèi)克爾兒童醫(yī)院開展了 X 染色體相關聯(lián)的重癥聯(lián)合免疫缺陷病的基因治療臨床試驗[22]。而目前我國已有 3 項基因治療新藥方案經(jīng)我國國家食品藥品監(jiān)管局（SFDA）批準進入臨床試驗階段[23]。據(jù) Wiley 統(tǒng)計，截止至 2017 年 4 月臨床基因治療的病例中，用于治療癌癥相關疾病占比 64.6%（見圖 1.1）[24]。

聲波介導）、化學方法（通過人工合成的化學物質(zhì)如脂質(zhì)體和陽離子聚合物介）和生物方法（以病毒載體如慢病毒和腺病毒導入 DNA）。其中，化學方法和物方法實現(xiàn)成功的基因治療都依賴于高效的基因傳輸載體來搭載基因藥物，所獲得合適的基因載體，是基因治療的關鍵。1.1.3 基因載體的分類基因載體，是基因藥物的運輸工具，是它的搭載體系。主要分為病毒類載體非病毒類載體[26, 27]。在基因遞送過程中，如果沒有載體的保護，裸 DNA 極易降解。所以有效、低毒的基因載體對于基因治療十分必要。1.1.3.1 病毒類載體病毒類載體轉(zhuǎn)染效率高，截止至 2017 年，約有 67%的基因治療臨床試驗均用病毒載體（圖 1.2）。病毒類載體分為 DNA 類病毒載體和 RNA 類病毒載體[24]。

圖 1.3 各種不同結(jié)構(gòu)的非病毒載體與基因的復合物[50]（1） 磷酸鈣磷酸鈣是最早的 DNA 轉(zhuǎn)染材料之一，是一種天然的生物材料，可以與 DNA 混共沉淀成納米顆粒，且自身具有良好的生物安全性和可降解性[51]。但有觀點認為種納米顆粒會提早釋放DNA，使DNA在細胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)運困難，不能進入細胞核[52]。且隨著轉(zhuǎn)染時間的增加，納米粒的尺寸也增加，從而導致轉(zhuǎn)染效率不高[53]。（2） 陽離子脂質(zhì)體陽離子脂質(zhì)體由疏水基團、連接臂、親水性陽離子頭基三部分組成。其中疏水鏈的長度和轉(zhuǎn)染效率有關[54, 55]，而其連接臂會影響陽離子脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和生物解性[56]，復合物膜融合的程度受到親水性陽離子頭基的水和程度影響[57]。陽離子質(zhì)體作為基因載體的優(yōu)點是其具有類細胞膜特性，在轉(zhuǎn)染時基因的生物學活性不破壞。但陽離子脂質(zhì)體存在臨床試驗效率低（在壓縮 DNA 方面效率低）和毒性問題。（3） 陽離子聚合物[58

【參考文獻】

相關期刊論文 前6條

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