膿毒癥所致急性腎損傷(Acute kidney injury,AKI)是膿毒癥最常見的并發(fā)癥之一,發(fā)病機制不完全清楚,臨床治療措施有限,死亡率高。深入探討膿毒癥AKI的發(fā)病機制是目前腎臟病及危重病領(lǐng)域的熱點問題。它的發(fā)病機制除了通常的微循環(huán)血流異常,炎癥,細胞對損傷的自適應(yīng)反應(yīng)和微粒子等。目前認為,免疫炎癥反應(yīng)在膿毒癥AKI中起重要作用。調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Treg)在膿毒癥時免疫抑制狀態(tài)中起關(guān)鍵作用,它主要通過細胞接觸機制和細胞因子分泌方式起抑制作用,其介導免疫細胞凋亡和免疫麻痹,抑制Treg可改善膿毒癥預后。TGF-β與IL-10是Treg分泌的主要的抑制性細胞因子,新發(fā)現(xiàn)IL-35具更強抑制作用。它能抑制T細胞增殖和Th17的分化及IL-17的產(chǎn)生,明顯降低炎癥反應(yīng),在多種感染性疾病和自身免疫性疾病中參與炎癥的免疫調(diào)節(jié)。并在腫瘤等疾病中與細胞凋亡有關(guān),是近期免疫研究的新熱點。本研究擬從IL-35和免疫狀態(tài)方面著手,觀察膿毒癥AKI時死亡率和AKI發(fā)生率的關(guān)系,明確腎組織的病理改變,探討炎癥因子IL-35的變化規(guī)律及其與腎組織損傷的關(guān)系,為闡明膿毒癥AKI的發(fā)生機理提供新的理論依據(jù)。一、實驗方法1、小鼠膿毒癥時AKI發(fā)生率與死亡率的關(guān)系采用盲腸結(jié)扎穿孔誘導膿毒癥(cecal ligation and puncture,CLP)急性腎損傷模型。模型復制12次,每次取小鼠20只。調(diào)整術(shù)中盲腸穿孔個數(shù)和大小,致術(shù)后24h小鼠死亡率高低不同。術(shù)后24h處死小鼠,檢測血Cr、BUN、ALT、AST水平。行腎組織PAS染色評估腎組織損傷,行Tunel染色檢測腎臟細胞凋亡情況。采用Pearson統(tǒng)計分析小鼠死亡率和術(shù)后AKI發(fā)生率的相關(guān)性。2、IL-35在小鼠膿毒癥AKI中的表達變化C57雄性小鼠行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)誘導膿毒癥AKI,膿毒癥AKI組包括11只術(shù)后24小時誘導出AKI的小鼠,對照組為8只行假手術(shù)的小鼠。免疫組化法檢測IL-35兩個亞基IL12A、EBI3在腎臟局部的表達部位,免疫熒光法分析亞基IL12A、EBI3在腎臟局部是否共表達。RT-PCR法檢測IL-35的亞基IL12A、EBI3的mRNA表達水平,ELISA檢測腎組織IL-35蛋白水平。采用Pearson統(tǒng)計分析腎臟IL-35水平與血清Cr、BUN、ALT、AST水平的相關(guān)性。3、LPS刺激腎小管上皮細胞后IL-35的變化細胞在含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,37℃、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至密度達90%時換用無血清DMED同步化24 h后。分別20ug/ml LPS刺激0 h、4 h、8 h、16 h及24 h收集細胞和培養(yǎng)上清。檢測上清液LDH 水平,MTT法檢測細胞存活率,流式細胞術(shù)檢測凋亡率,RT-PCR法檢測IL-35的亞基IL12A、EBI3的mRNA表達水平。以脂質(zhì)體 LipofectamineTM 2000 5μl 加 IL-35siRNA8ul、對照 siRNA8ul 轉(zhuǎn)染 HKC,以rIL-35共培養(yǎng)HKC細胞24h后,熒光顯微鏡觀察細胞轉(zhuǎn)染效率。RT-PCR法檢測各組細胞亞基EBI3的mRNA表達。然后以20ug/ml LPS刺激各組細胞24 h,細胞分為對照組、HKC + LPS 組、rIL-35 + LPS 組、對照 siRNA + LPS 組、IL-35siRNA + LPS組。同法測定細胞上清LDH水平、細胞存活率、細胞凋亡率的變化。二、結(jié)果1、膿毒癥AKI病理改變及AKI發(fā)生情況PAS染色見膿毒癥AKI小鼠腎臟病理改變顯示,各段腎小管上皮細胞低平、空泡變性,部分崩解脫落。腎間質(zhì)水腫,少許炎細胞浸潤。TUNEL染色證實,膿毒癥AKI小鼠腎小管上皮細胞較多細胞為陽性染色。生化檢測AKI時常伴有肝功能ALT、AST明顯升高。并且膿毒癥后小鼠死亡率越高時,AKI的發(fā)生率也越高,Pearson相關(guān)分析證實膿毒癥AKI發(fā)生率與死亡率(r= 0.893,p=0.001)呈顯著負相關(guān)。2、IL-35可在腎小管上皮細胞表達,與腎功能異常相關(guān)免疫組化法檢測發(fā)現(xiàn),膿毒癥AKI組和對照組腎臟中IL12A、EBI3亞基均在腎小管上皮細胞表達,但腎小球和腎小血管中未見這兩個亞基的表達,半定量計數(shù)證實膿毒癥AKI組IL12A、EBI3水平較對照組明顯降低(p0.05)。免疫熒光法檢測證明IL12A、EBI3亞基在膿毒癥AKI組和對照組動物腎小管上皮細胞共表達,而在腎小球細胞中無表達。同時,膿毒癥AKI組腎臟IL12A、EBI3的mRNA表達均較對照組顯著降低(p0.05)。腎組織IL-35蛋白水平在膿毒癥AKI組為182.39±29.18ng/mgTP,較對照組260.87±69.03 ng/mgTP明顯降低(p0.05)。Pearson相關(guān)分析證實,腎臟局部IL-35蛋白水平與血清 Cr(r=-0.584,p=0.009)、ALT(r=-0.549,p=0.015)、AST(r=-0.475,p=0.04)水平呈顯著相關(guān)性,而與血清BUN水平無相關(guān)性(r=-0.437,p=0.061)。3、抑制IL-35表達能增加腎小管上皮細胞凋亡率體外試驗發(fā)現(xiàn),LPS刺激HKC后,隨著刺激時間延長,細胞上清LDH水平升高,凋亡率增加。IL-35mRNA在未受刺激的人腎小管上皮細胞不表達,在LPS刺激后其表達呈現(xiàn)先升高后降低。干預實驗發(fā)現(xiàn)LPS刺激HKC細胞24小時后,與對照組比較rIL-35組、對照siRNA組、IL-35siRNA組上清LDH水平均明顯升高(p0.05)。HKC+ LPS組、rIL-35 + LPS組、對照siRNA + LPS組的細胞凋亡率沒有明顯差異(p0.05),但是IL-35siRNA + LPS組較其他各組,細胞凋亡率明顯升高(p0.05)。三、結(jié)論體內(nèi)和體外實驗結(jié)果均表明,腎小管上皮細胞可表達炎癥因子IL-35。IL-35的mRNA和蛋白水平在膿毒癥AKI時較對照組表達水平下降,IL-35與腎功能、肝功能水平呈相關(guān)性。抑制IL-35的表達可以加重腎小管上皮細胞凋亡。提示腎小管上皮細胞表達的IL-35可能通過影響腎小管上皮細胞凋亡在膿毒癥AKI時起保護作用。
【學位單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R459.7;R692
【部分圖文】：

、腎功能變化逡逑小鼠腎臟ＣＬＰ術(shù)后２４ｈ血清Ｃｒ、ＢＵＮ水平較假手術(shù)組明顯升高（Ｐ＜邋０．０５），ＡＬＴ、逡逑ＡＳＴ水平也較假手術(shù)組明顯升高（Ｐ＜０．０５Ｍ圖１，表１）。表明膿毒癥所致急性腎損傷模逡逑型造模成功，且膿毒癥所致急性腎損傷小鼠同時伴有明顯的肝功能損傷（圖２）。逡逑Ｉ立黎■逡逑圖１小鼠行ＣＬＰ術(shù)復制ＡＫＩ動物模型逡逑表１小鼠ＣＬＰ術(shù)后各組ＳＣｒ、ＢＵＮ、ＡＬＴ水平的變化逡逑Ｓｈａｍ邋（ｎ＝８）邐膿毒癥邋ＡＫＩ逡逑（ｎ＝ｌｌ）逡逑Ｃｒ（ｕｍｏｌ／Ｌ）邐１０．５３±２．１８邐３２．３４±１７．３２＊逡逑ＢＵＮ（ｍｍｏｌ／Ｌ）邐８．４５±１．０２邐２５．４８±１５．６１＊逡逑ＡＬＴ（Ｕ／Ｌ）邐３４．０６±１３．２０邐１３２．８０±４８．２０＊逡逑ＡＳＴ（Ｕ／Ｌ）邐１１４．４１±４９．１９邐５２５．６８±３８４．８４＊逡逑Ｄａｔａ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｍｅａｎ土ＳＥＭ邋＊ｐ＜０．０５邋ｖｅｒｓｕｓ邋ｓｈａｍ．逡逑１３逡逑

小鼠腎臟ＣＬＰ術(shù)后２４ｈ血清Ｃｒ、ＢＵＮ水平較假手術(shù)組明顯升高（Ｐ＜邋０．０５），ＡＬＴ、逡逑ＡＳＴ水平也較假手術(shù)組明顯升高（Ｐ＜０．０５Ｍ圖１，表１）。表明膿毒癥所致急性腎損傷模逡逑型造模成功，且膿毒癥所致急性腎損傷小鼠同時伴有明顯的肝功能損傷（圖２）。逡逑Ｉ立黎■逡逑圖１小鼠行ＣＬＰ術(shù)復制ＡＫＩ動物模型逡逑表１小鼠ＣＬＰ術(shù)后各組ＳＣｒ、ＢＵＮ、ＡＬＴ水平的變化逡逑Ｓｈａｍ邋（ｎ＝８）邐膿毒癥邋ＡＫＩ逡逑（ｎ＝ｌｌ）逡逑Ｃｒ（ｕｍｏｌ／Ｌ）邐１０．５３±２．１８邐３２．３４±１７．３２＊逡逑ＢＵＮ（ｍｍｏｌ／Ｌ）邐８．４５±１．０２邐２５．４８±１５．６１＊逡逑ＡＬＴ（Ｕ／Ｌ）邐３４．０６±１３．２０邐１３２．８０±４８．２０＊逡逑ＡＳＴ（Ｕ／Ｌ）邐１１４．４１±４９．１９邐５２５．６８±３８４．８４＊逡逑Ｄａｔａ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｍｅａｎ土ＳＥＭ邋＊ｐ＜０．０５邋ｖｅｒｓｕｓ邋ｓｈａｍ．逡逑１３逡逑

者是上皮細胞排列紊亂。并出現(xiàn)明顯的基底膜裸露，部分上皮細胞脫落，管腔內(nèi)見脫逡逑落的細胞及細胞碎片，腎間質(zhì)水腫，淋巴細胞和單核細胞浸潤。（圖３）。腎小管損傷逡逑評分見膿毒癥ＡＫＩ后評分明顯升高（Ｐ＜邋０．０５）。（圖４）逡逑Ｗ．邐．邋Ｕ—．＇邐．．．卜——邐＇邐－逡逑ｖ．．．卜．．ｖ＇ｍ邋＜？邐、邐？邋■邋．邋．邐■逡逑■，，．敦．逡逑八，？．．邐…逡逑？Ｖ邋．邐．邐？邐、？邐．．？邐，逡逑．．悐？？、？邋．．．邋＊邐？邐，逡逑，邐Ａ邐Ｂ逡逑＇二－－．ｍ邐■邋／邋？逡逑１４逡逑

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