第一部分建立多重四引物擴增受阻突變體系PCR方法同時檢測四個葉酸代謝通路相關SNP位點目的:建立多重四引物擴增受阻突變體系PCR(M-T-ARMS-PCR)檢測方法,實現(xiàn)單管一次性檢測葉酸代謝通路相關的四個SNP位點:5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)C677T位點(rs1801133),A1298C位點(rs1801131),以及蛋氨酸合成酶(MS)A2756G位點(rs1805087)和蛋氨酸合成酶還原酶(MTRR)A66G位點(rs1801394)。方法:于2016年1月至2017年4月,在河北省兒童醫(yī)院檢驗科收集200例健康體檢兒童的抗凝全血標本。利用T-ARMS-PCR原理及多重嵌合引物策略設計rs1801133,rs1801131,rs1805087和rs1801394位點的特異性內(nèi)外嵌合引物。通過優(yōu)化引物濃度和反應條件,經(jīng)單管PCR反應后結合QIAxcel毛細管電泳分析擴增產(chǎn)物長度,判讀標本以上四個SNP位點的基因型,并與直接測序法所得結果進行比較。結果:本研究所建立的多重T-ARMS-PCR結合毛細管電泳分析的方法可在3小時內(nèi)一次性識別葉酸代謝通路相關的四個SNP位點的8個不同等位基因,可對200例全血標本的SNP位點準確分型,其分型結果與測序法完全相符。結論:本研究所建立的多重T-ARMS-PCR方法,可簡單、快速、準確地實現(xiàn)單管一次性檢測葉酸代謝通路相關的四個SNP位點。第二部分四個葉酸代謝通路相關SNP位點與先天性心臟病相關性的研究目的:探究5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)C677T位點,A1298C位點,以及蛋氨酸合成酶(MS)A2756G位點和蛋氨酸合成酶還原酶(MTRR)A66G位點多態(tài)性與先天性心臟病(CHD)之間的關系。方法:采用病例-對照研究,限制相應條件于2016年1月至2017年4月在河北省兒童醫(yī)院心臟外科收集了200名CHD患兒作為病例組,200名健康體檢兒童作為對照組。采用多重T-ARMS-PCR方法檢測兩組兒童的MTHFR C677T和A1298C位點,MS A2756G位點,以及MTRR A66G位點的基因型及其分布,并采用SPSS21.0軟件的χ~2檢驗來分析上述4個SNP位點與全部CHD以及單一和多發(fā)畸形型CHD發(fā)病風險之間的關系。結果:MTHFR C677T位點的等位基因T攜帶者相對于等位基因C攜帶者發(fā)生CHD的OR=2.47(95%CI:1.86~3.29,P0.001)。與純合子CC型比較,CT型雜合子個體患CHD的OR=2.32(95%CI:1.35~3.98,P0.05),而TT型純合突變個體患CHD的風險是CC型個體的5.37倍(95%CI:3.01~9.60,P0.001);MTHFR A1298C位點等位基因C攜帶者相比于等位基因A攜帶者發(fā)生CHD的OR=0.53(95%CI:0.36~0.77,P0.05)。雜合子AC型個體患病風險低于野生型純合子AA個體OR=0.41(95%CI:0.26~0.64,P0.001);在分類后的單一及多發(fā)畸形型CHD中,以上兩個位點的等位基因頻率及基因型頻率依然具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。以上兩位點的組合基因型分析顯示:相比于攜帶雙野生型CC/AA的個體,攜帶CT/AA的個體患病風險增加到了4.65倍(95%CI:2.16~10.02);TT/AA型個體增加到了7.05倍(95%CI:3.37~14.79)。統(tǒng)計結果表明MS A2756G和MTRR A66G位點無論是對全部CHD還是對分類后的單一及多發(fā)畸形型CHD的發(fā)生均無影響(P0.05)。結論:MTHFR C677T位點的突變型等位基因T可能是CHD的危險因素,A1298C位點的突變型等位基因C可能為CHD的保護因素,這兩個位點對CHD的發(fā)生可能存在聯(lián)合作用。
【學位單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R446.11;R541.1
【部分圖文】：

-ARMS-PCR原理圖

研 究 論 文15圖2 直接測序法判讀樣本四個SNP位點分型情況Fig.2 Genotyping of the four SNPs by direct sequencing

圖 3 單一位點引物特異性驗證Fig.3 The verification of primers' specificity of each single SNP

【參考文獻】

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本文編號：2829927