第一部分建立多重四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR方法同時(shí)檢測(cè)四個(gè)葉酸代謝通路相關(guān)SNP位點(diǎn)目的:建立多重四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR(M-T-ARMS-PCR)檢測(cè)方法,實(shí)現(xiàn)單管一次性檢測(cè)葉酸代謝通路相關(guān)的四個(gè)SNP位點(diǎn):5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)C677T位點(diǎn)(rs1801133),A1298C位點(diǎn)(rs1801131),以及蛋氨酸合成酶(MS)A2756G位點(diǎn)(rs1805087)和蛋氨酸合成酶還原酶(MTRR)A66G位點(diǎn)(rs1801394)。方法:于2016年1月至2017年4月,在河北省兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科收集200例健康體檢兒童的抗凝全血標(biāo)本。利用T-ARMS-PCR原理及多重嵌合引物策略設(shè)計(jì)rs1801133,rs1801131,rs1805087和rs1801394位點(diǎn)的特異性內(nèi)外嵌合引物。通過優(yōu)化引物濃度和反應(yīng)條件,經(jīng)單管PCR反應(yīng)后結(jié)合QIAxcel毛細(xì)管電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度,判讀標(biāo)本以上四個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型,并與直接測(cè)序法所得結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果:本研究所建立的多重T-ARMS-PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳分析的方法可在3小時(shí)內(nèi)一次性識(shí)別葉酸代謝通路相關(guān)的四個(gè)SNP位點(diǎn)的8個(gè)不同等位基因,可對(duì)200例全血標(biāo)本的SNP位點(diǎn)準(zhǔn)確分型,其分型結(jié)果與測(cè)序法完全相符。結(jié)論:本研究所建立的多重T-ARMS-PCR方法,可簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)單管一次性檢測(cè)葉酸代謝通路相關(guān)的四個(gè)SNP位點(diǎn)。第二部分四個(gè)葉酸代謝通路相關(guān)SNP位點(diǎn)與先天性心臟病相關(guān)性的研究目的:探究5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)C677T位點(diǎn),A1298C位點(diǎn),以及蛋氨酸合成酶(MS)A2756G位點(diǎn)和蛋氨酸合成酶還原酶(MTRR)A66G位點(diǎn)多態(tài)性與先天性心臟病(CHD)之間的關(guān)系。方法:采用病例-對(duì)照研究,限制相應(yīng)條件于2016年1月至2017年4月在河北省兒童醫(yī)院心臟外科收集了200名CHD患兒作為病例組,200名健康體檢兒童作為對(duì)照組。采用多重T-ARMS-PCR方法檢測(cè)兩組兒童的MTHFR C677T和A1298C位點(diǎn),MS A2756G位點(diǎn),以及MTRR A66G位點(diǎn)的基因型及其分布,并采用SPSS21.0軟件的χ~2檢驗(yàn)來分析上述4個(gè)SNP位點(diǎn)與全部CHD以及單一和多發(fā)畸形型CHD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系。結(jié)果:MTHFR C677T位點(diǎn)的等位基因T攜帶者相對(duì)于等位基因C攜帶者發(fā)生CHD的OR=2.47(95%CI:1.86~3.29,P0.001)。與純合子CC型比較,CT型雜合子個(gè)體患CHD的OR=2.32(95%CI:1.35~3.98,P0.05),而TT型純合突變個(gè)體患CHD的風(fēng)險(xiǎn)是CC型個(gè)體的5.37倍(95%CI:3.01~9.60,P0.001);MTHFR A1298C位點(diǎn)等位基因C攜帶者相比于等位基因A攜帶者發(fā)生CHD的OR=0.53(95%CI:0.36~0.77,P0.05)。雜合子AC型個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)低于野生型純合子AA個(gè)體OR=0.41(95%CI:0.26~0.64,P0.001);在分類后的單一及多發(fā)畸形型CHD中,以上兩個(gè)位點(diǎn)的等位基因頻率及基因型頻率依然具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。以上兩位點(diǎn)的組合基因型分析顯示:相比于攜帶雙野生型CC/AA的個(gè)體,攜帶CT/AA的個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)增加到了4.65倍(95%CI:2.16~10.02);TT/AA型個(gè)體增加到了7.05倍(95%CI:3.37~14.79)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明MS A2756G和MTRR A66G位點(diǎn)無論是對(duì)全部CHD還是對(duì)分類后的單一及多發(fā)畸形型CHD的發(fā)生均無影響(P0.05)。結(jié)論:MTHFR C677T位點(diǎn)的突變型等位基因T可能是CHD的危險(xiǎn)因素,A1298C位點(diǎn)的突變型等位基因C可能為CHD的保護(hù)因素,這兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)CHD的發(fā)生可能存在聯(lián)合作用。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R446.11;R541.1
【部分圖文】：

-ARMS-PCR原理圖

研 究 論 文15圖2 直接測(cè)序法判讀樣本四個(gè)SNP位點(diǎn)分型情況Fig.2 Genotyping of the four SNPs by direct sequencing

圖 3 單一位點(diǎn)引物特異性驗(yàn)證Fig.3 The verification of primers' specificity of each single SNP

【參考文獻(xiàn)】

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1 王倩;閆雯;沈明輝;馬克君;郜莉娜;尤崇革;;熒光染料SYTO13用于高分辨熔解曲線技術(shù)SNP基因分型的評(píng)價(jià)[J];中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2017年02期

2 章曉鷹;張玨;;亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性研究進(jìn)展[J];中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2016年07期

3 李棟;于坤坤;馬衍輝;劉一志;紀(jì)龍;;5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與先天性心臟病的關(guān)聯(lián)研究[J];衛(wèi)生研究;2015年06期

4 高軍;房志雄;;警惕先心病發(fā)病率明顯上升的趨勢(shì)[J];首都食品與醫(yī)藥;2015年07期

5 陳霖;劉佳;劉愛霞;劉立明;趙靜;徐軍;張嵐;戴亮;王衛(wèi)東;楊麗華;毛遠(yuǎn)麗;李伯安;;基于擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)實(shí)時(shí)熒光PCR的IL28B基因SNP位點(diǎn)聯(lián)合檢測(cè)方法的建立[J];中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志;2014年06期

6 宋文芳;任燦晴;沈秋紅;蔣躍明;劉楠;;育齡婦女葉酸代謝通路關(guān)鍵酶基因多態(tài)性對(duì)血漿同型半胱氨酸水平的影響[J];中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2014年10期

7 徐菲;孫奉R

本文編號(hào)：2829927