目的探討結(jié)核分枝桿菌多聚磷酸鹽激酶2(PPK2)核酸適配體(aptamer)與體外結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)共培養(yǎng)來評估其抑菌效果。為開發(fā)新的高效、低毒的抗結(jié)核藥物提供新的方向。方法1.運用生物信息學方法分析PPK2蛋白氨基酸序列與呼吸道部分常見病原菌同源性進行分析,并構(gòu)建PPK2進化樹。2.將PPK2核酸適配體與MTB標準株H_(37)Rv、卡介苗(BCG)、恥垢分枝桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌,通過酶聯(lián)寡核苷酸分析(enzyme-linked oligonucleotide assay,ELONA)方法測定PPK2核酸適配體與H_(37)Rv結(jié)合親和力,用相同的方法檢測PPK2適配體與正常人、結(jié)核病人血清中PPK2蛋結(jié)合的親和力。3.將PPK2核酸適配體加入不同濃度血清中共孵育24h,運用瓊脂糖凝膠電泳分析其在不同濃度血清中的生物穩(wěn)定性。4.采用微量刃天青顯色法測定PPK2核酸適配體對H_(37)Rv的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)。5.將H_(37)Rv與1μmol/L的PPK2核酸適配體、隨機序列接種到羅氏培養(yǎng)基,觀察PPK2適配體與隨機序列對H_(37)Rv生長影響。將H_(37)Rv與PPK2核酸適配體、突變體共培養(yǎng)10d,運用酶標儀測定D(600nm)值,觀察PPK2核酸適配體對H_(37)Rv的生長影響。6.將H_(37)Rv與PPK2適配體共培養(yǎng)5周,采用結(jié)晶紫染色法觀察PPK2適配體對MTB生物膜生長的影響。7.將PPK2核酸適配體與細胞共培養(yǎng),觀察核酸適配體對細胞毒性。結(jié)果1.生物信息學方法分析構(gòu)建PPK2進化樹顯示H_(37)Rv的PPK2蛋白與呼吸道部分常見病原菌親緣性較遠,與銅綠假單胞菌親緣關(guān)系相對較近。2.通過ELONA測定顯示PPK2核酸適配體能與H_(37)Rv的PPK2蛋白選擇性結(jié)合,在正常人與結(jié)核病病人血清中PPK2核酸適配體在結(jié)核病病人血清表現(xiàn)出較好的親和力。3.瓊脂糖凝膠電泳分析PPK2核酸適配體在血清中至少穩(wěn)定存在8h。4.PPK2核酸適配體對結(jié)核分枝桿菌標準株H_(37)Rv的MIC為50nmol/L。5.羅氏培養(yǎng)基菌落生長顯示PPK2適配體對H_(37)Rv生長具有抑制作用。生長抑制試驗表明隨著PPK2核酸適配體濃度增加H_(37)Rv的D(600nm)值呈現(xiàn)下降趨勢,說明PPK2核酸適配體對H_(37)Rv生長存在抑制作用。6.PPK2核酸適配體與MTB共培養(yǎng)5周,經(jīng)過結(jié)晶紫染色法測定顯示PPK2核酸適配體影響MTB生物膜形成。7.細胞毒性試驗顯示高濃度與低濃度PPK2核酸適配體對細胞均無毒性。結(jié)論1.PPK2蛋白核酸適配體對體外H_(37)Rv表現(xiàn)出良好的抑菌活性。2.PPK2核酸適配體能夠與結(jié)核病人血清PPK2蛋白選擇性結(jié)合。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R446.5
【部分圖文】：

注：A. 鄰接法；B. 最大似然法。圖 1 PPK2 蛋白進化樹Fig 1 PPK2 protein molecular phylogenetic tree2.2 ELONA 測定 PPK2 核酸適配體與 H37Rv 選擇性結(jié)合

注：①P=0.002，②P=0.000。圖 2 酶聯(lián)寡核苷酸分析測定 PPK2 核酸適配體與幾種常見菌株的親和力ig 2 Affinity of PPK2 aptamer and several common bacterial strains detected by ELONA PPK2 核酸適配體與結(jié)核病人血清結(jié)合實驗

注：P=0.0001酸分析測定 PPK2 核酸適配體與結(jié)核病人血清中 PK2 aptamer and PPK2 protein in serum of Tubercuby ELONA適配體的生物穩(wěn)定性酸適配體在不同濃度血清中的生物穩(wěn)定性，將、5%血清及無血清的稀釋液中，經(jīng) 3%瓊脂糖見唯一清晰的特異性條帶，在 24 h 見條帶出配體在不同濃度血清中能穩(wěn)定存在至少 8 h。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陳軍;陳志飛;饒有益;陳麗峰;王飛;肖勇;;微量刃天青顯色法快速測定結(jié)核分枝桿菌MIC及菌型鑒定[J];臨床檢驗雜志;2011年03期

本文編號：2828199