上海2家教學醫(yī)院曲霉菌臨床株的遺傳多樣性及藥敏監(jiān)測研究

發(fā)布時間：2020-09-27 14:56

　　研究背景曲霉菌(Aspergillus)是一類廣泛分布于自然界的絲狀真菌,約300余種,其中大多數曲霉菌種僅無性階段被描述,屬于半知菌;少數菌種如煙曲霉已同時發(fā)現(xiàn)并描述無性及有性階段,被歸入子囊菌。曲霉菌常見于濕潤的土壤、發(fā)霉腐爛的面包、谷類等,其中少數菌種可感染人類導致嚴重疾病。近年來,由于免疫抑制人群數量的增多,侵襲性曲霉感染的發(fā)病率呈上升趨勢,尤其是易于累及造血干細胞、實體器官移植后及接受免疫抑制劑治療的患者,其早期診斷困難,死亡率長期居高不下。煙曲霉是臨床最主要的致病曲霉菌種,近年來發(fā)現(xiàn)其對唑類藥物耐藥率不斷上升,且非煙曲霉感染引起的侵襲性曲霉菌病也不斷增加。值得注意的是,曲霉菌各菌種對抗真菌藥物的敏感性有顯著不同。目前臨床上傳統(tǒng)的曲霉菌鑒定模式,不能及時準確的將菌株鑒定至種的水平,這常常制約臨床采取恰當的治療方案。目前我國絕大多數地區(qū),包括上海等醫(yī)療中心城市,有關的曲霉菌臨床分離菌株的遺傳多態(tài)性及體外對抗真菌藥物敏感性監(jiān)測等研究工作還很不夠,尤其缺乏系統(tǒng)地持續(xù)性監(jiān)測調查。因此,本研究隨機選取了上海地區(qū)2家三級甲等醫(yī)科大學附屬醫(yī)院,對分離自深部體液樣本的曲霉菌株進行了持續(xù)2年的分離、培養(yǎng)及保藏,并應用最新的分子標記技術及藥敏監(jiān)測操作規(guī)范,對相關曲霉菌臨床分離株的種群遺傳多態(tài)性以及藥物敏感性進行研究,為提高上海乃及我國的曲霉病臨床診治水平提供有價值的參考依據及研究基礎。研究目的第一,通過多基因測序及序列分析等分子標記技術對相關曲霉菌株進行分子鑒定及遺傳多樣性分析,明確相關曲霉菌株的種群構成及種內遺傳變異特征;第二,通過體外藥敏試驗調查相關菌株對現(xiàn)有抗真菌藥物敏感性特征,為臨床合理用藥提供科學參考;第三,對篩選出的曲霉菌耐藥煙曲霉菌株,檢測其唑類耐藥突變位點,初步分析其耐藥的演化分子機制。研究方法第一部分對分離自上海地區(qū)兩家教學醫(yī)院住院患者的深部體液樣本的相關菌株,采用核酸擴增技術分別對ribosomal internal transcribed spacer region(ITS)、β-tubulin和calmodulin三個基因片段進行擴增測序,與NCBI數據庫進行BLAST比對后初步鑒定至種水平;分別利用上述三個基因及聯(lián)用其序列,利用MEGA7.0軟件,采用K2+G模型和K2+G+I模型,利用最大似然法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,將每一菌株鑒定至種的水平,并比較ITS,β-tubulin和calmodulin三個單基因片段序列對鑒定曲霉菌屬的優(yōu)劣。第二部分利用最新的肉湯微量稀釋法(CLSI M38-A2方案),對相關曲霉菌臨床分離株進行9種臨床一線抗真菌藥物的體外敏感性試驗,并篩選出耐藥菌株。第三部分將藥敏試驗中篩選出的對唑類耐藥煙曲霉進行cyp51A基因的擴增及測序,與唑類敏感煙曲霉菌株(GenBank accession no.AF338659)進行序列比對,確定其耐藥突變位點。結果第一部分本研究中收集的菌株菌種構成包括煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)、聚多曲霉(Aspergillus sydowii)、溜曲霉(Aspergillus tamarii)、構巢曲霉(Aspergillusnidulans)和土曲霉(Aspergillus terreus)共9種曲霉菌,其中以煙曲霉(54.6%;59/108)為主。相關菌株主要分離自呼吸系統(tǒng)標本(90.7%;98/108),且煙曲霉(58.2%;57/98)為呼吸系統(tǒng)的最主要致病曲霉菌;然而在來自非呼吸系統(tǒng)標本的曲霉菌株中,非煙曲霉菌(75%;6/8)多于煙曲霉(25%;2/8)。第二部分在本研究中應用的棘白菌素類、唑類和多烯類等9種抗真菌藥物中,棘白菌素類藥物對相關曲霉菌菌株的抗菌活性最高(MEC_(50) 0.03μg/ml;MEC_(90)0.25μg/ml),其次為唑類(MIC_(50) 0.5μg/ml;MIC_(90) 2μg/ml)及多烯類(MIC_(50) 1μg/ml;MIC_(90)2μg/ml)。其中棘白菌素類藥物中以阿尼芬凈的敏感性最高(MEC_(50) 0.03μg/ml;MEC_(90)0.03μg/ml);唑類藥物中以泊沙康唑的敏感性最高(MIC_(50) 0.25μg/ml;MIC_(90) 0.5μg/ml)。另外,我們發(fā)現(xiàn)相當比例的菌株(34.3%的MIC值≥2μg/ml)對兩性霉素B敏感性下降,值得警惕及后續(xù)相關研究進一步監(jiān)測。第三部分本次研究中發(fā)現(xiàn)煙曲霉的唑類耐藥率約6.8%,且首次在上海地區(qū)發(fā)現(xiàn)存在TR46/Y121F/T289A突變位點的煙曲霉菌株;同時,我們還發(fā)現(xiàn)了2株對唑類耐藥的煙曲霉菌株同時存在F46Y,G89G,M172V,N248T,D255E的突變位點。結論本研究中收集自2所教學醫(yī)院的曲霉菌臨床分離菌株種類主要包括煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、塔賓曲霉、聚多曲霉、溜曲霉、構巢曲霉和土曲霉這8個菌種,煙曲霉仍是優(yōu)勢致病曲霉菌種。體外抗真菌藥敏試驗提示,棘白菌素類藥物對本次研究收集的曲霉菌株的抗菌活性最高,其次為唑類、多烯類。煙曲霉菌株對唑類耐藥率有所上升,且相關耐藥突變位點存在豐富的多樣性,且首次在上海地區(qū)發(fā)現(xiàn)含TR46/Y121F/T289A突變位點的交叉耐藥煙曲霉菌株,提示相關耐藥菌株存在多種起源及演化途徑,值得真菌病學、醫(yī)學真菌學及流行病學等領域的學者警惕,未來在上海地區(qū)就煙曲霉臨床與環(huán)境分離菌株對唑類藥物的耐藥趨勢進行系統(tǒng)的、長期的監(jiān)測研究對于臨床侵襲性曲霉病的診治是非常必要的。
【學位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R446.5
【部分圖文】：

序列,基因,峰值,曲霉

圖 2. ITS、BenA、CaM 基因峰值圖（五）分子鑒定結果在 NCBI 官方網站中的核酸 BLAST 中，將上述所有 ITS、BenA、CaM 基因的擴增產物序列與 Genbank 數據庫中的標準菌株進行比對分析后結果顯示：ITS 序列將曲霉菌分類到物種復合體水平，包含煙曲霉屬 59 株(54.6%)，黃曲霉屬 25 株(23.2%)，黑曲霉屬 20 株(18.5%)，雜色曲霉屬 2 株(A.versicolor complex; 1.9%)，土曲霉屬 1 株(0.9%)，構巢曲霉 1 株(0.9%)；除上述常見菌種以外，BenA 基因還鑒定出少見物種株(8.3%)，其中以塔賓曲霉(A. tubingensis; 5.5%, 6/108)為主，其次為聚多曲霉(A.sydowii; 1.9%, 2/108)，溜曲霉(A. tamarii; 0.9%, 1/108)；由 CaM 基因鑒定的少見物種有18株(16.7%)，其中以塔賓曲霉(5.5%, 6/108)為主；其次為新愛耳曲霉(A. neoelliptic3.7%, 4/108)，泡盛曲霉(A. awamori; 2.8%, 3/108)，聚多曲霉(1.9%, 2/108)，A.effusu(1.9%, 2/108)，溜曲霉(0.9%, 1/108)。具體結果請見表 1、表 2。

系統(tǒng)進化樹,曲霉菌,基因序列