研究背景曲霉菌(Aspergillus)是一類廣泛分布于自然界的絲狀真菌,約300余種,其中大多數(shù)曲霉菌種僅無性階段被描述,屬于半知菌;少數(shù)菌種如煙曲霉已同時(shí)發(fā)現(xiàn)并描述無性及有性階段,被歸入子囊菌。曲霉菌常見于濕潤(rùn)的土壤、發(fā)霉腐爛的面包、谷類等,其中少數(shù)菌種可感染人類導(dǎo)致嚴(yán)重疾病。近年來,由于免疫抑制人群數(shù)量的增多,侵襲性曲霉感染的發(fā)病率呈上升趨勢(shì),尤其是易于累及造血干細(xì)胞、實(shí)體器官移植后及接受免疫抑制劑治療的患者,其早期診斷困難,死亡率長(zhǎng)期居高不下。煙曲霉是臨床最主要的致病曲霉菌種,近年來發(fā)現(xiàn)其對(duì)唑類藥物耐藥率不斷上升,且非煙曲霉感染引起的侵襲性曲霉菌病也不斷增加。值得注意的是,曲霉菌各菌種對(duì)抗真菌藥物的敏感性有顯著不同。目前臨床上傳統(tǒng)的曲霉菌鑒定模式,不能及時(shí)準(zhǔn)確的將菌株鑒定至種的水平,這常常制約臨床采取恰當(dāng)?shù)闹委煼桨�。目前我�?guó)絕大多數(shù)地區(qū),包括上海等醫(yī)療中心城市,有關(guān)的曲霉菌臨床分離菌株的遺傳多態(tài)性及體外對(duì)抗真菌藥物敏感性監(jiān)測(cè)等研究工作還很不夠,尤其缺乏系統(tǒng)地持續(xù)性監(jiān)測(cè)調(diào)查。因此,本研究隨機(jī)選取了上海地區(qū)2家三級(jí)甲等醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,對(duì)分離自深部體液樣本的曲霉菌株進(jìn)行了持續(xù)2年的分離、培養(yǎng)及保藏,并應(yīng)用最新的分子標(biāo)記技術(shù)及藥敏監(jiān)測(cè)操作規(guī)范,對(duì)相關(guān)曲霉菌臨床分離株的種群遺傳多態(tài)性以及藥物敏感性進(jìn)行研究,為提高上海乃及我國(guó)的曲霉病臨床診治水平提供有價(jià)值的參考依據(jù)及研究基礎(chǔ)。研究目的第一,通過多基因測(cè)序及序列分析等分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)相關(guān)曲霉菌株進(jìn)行分子鑒定及遺傳多樣性分析,明確相關(guān)曲霉菌株的種群構(gòu)成及種內(nèi)遺傳變異特征;第二,通過體外藥敏試驗(yàn)調(diào)查相關(guān)菌株對(duì)現(xiàn)有抗真菌藥物敏感性特征,為臨床合理用藥提供科學(xué)參考;第三,對(duì)篩選出的曲霉菌耐藥煙曲霉菌株,檢測(cè)其唑類耐藥突變位點(diǎn),初步分析其耐藥的演化分子機(jī)制。研究方法第一部分對(duì)分離自上海地區(qū)兩家教學(xué)醫(yī)院住院患者的深部體液樣本的相關(guān)菌株,采用核酸擴(kuò)增技術(shù)分別對(duì)ribosomal internal transcribed spacer region(ITS)、β-tubulin和calmodulin三個(gè)基因片段進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序,與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)后初步鑒定至種水平;分別利用上述三個(gè)基因及聯(lián)用其序列,利用MEGA7.0軟件,采用K2+G模型和K2+G+I模型,利用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,將每一菌株鑒定至種的水平,并比較ITS,β-tubulin和calmodulin三個(gè)單基因片段序列對(duì)鑒定曲霉菌屬的優(yōu)劣。第二部分利用最新的肉湯微量稀釋法(CLSI M38-A2方案),對(duì)相關(guān)曲霉菌臨床分離株進(jìn)行9種臨床一線抗真菌藥物的體外敏感性試驗(yàn),并篩選出耐藥菌株。第三部分將藥敏試驗(yàn)中篩選出的對(duì)唑類耐藥煙曲霉進(jìn)行cyp51A基因的擴(kuò)增及測(cè)序,與唑類敏感煙曲霉菌株(GenBank accession no.AF338659)進(jìn)行序列比對(duì),確定其耐藥突變位點(diǎn)。結(jié)果第一部分本研究中收集的菌株菌種構(gòu)成包括煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)、聚多曲霉(Aspergillus sydowii)、溜曲霉(Aspergillus tamarii)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)和土曲霉(Aspergillus terreus)共9種曲霉菌,其中以煙曲霉(54.6%;59/108)為主。相關(guān)菌株主要分離自呼吸系統(tǒng)標(biāo)本(90.7%;98/108),且煙曲霉(58.2%;57/98)為呼吸系統(tǒng)的最主要致病曲霉菌;然而在來自非呼吸系統(tǒng)標(biāo)本的曲霉菌株中,非煙曲霉菌(75%;6/8)多于煙曲霉(25%;2/8)。第二部分在本研究中應(yīng)用的棘白菌素類、唑類和多烯類等9種抗真菌藥物中,棘白菌素類藥物對(duì)相關(guān)曲霉菌菌株的抗菌活性最高(MEC_(50) 0.03μg/ml;MEC_(90)0.25μg/ml),其次為唑類(MIC_(50) 0.5μg/ml;MIC_(90) 2μg/ml)及多烯類(MIC_(50) 1μg/ml;MIC_(90)2μg/ml)。其中棘白菌素類藥物中以阿尼芬凈的敏感性最高(MEC_(50) 0.03μg/ml;MEC_(90)0.03μg/ml);唑類藥物中以泊沙康唑的敏感性最高(MIC_(50) 0.25μg/ml;MIC_(90) 0.5μg/ml)。另外,我們發(fā)現(xiàn)相當(dāng)比例的菌株(34.3%的MIC值≥2μg/ml)對(duì)兩性霉素B敏感性下降,值得警惕及后續(xù)相關(guān)研究進(jìn)一步監(jiān)測(cè)。第三部分本次研究中發(fā)現(xiàn)煙曲霉的唑類耐藥率約6.8%,且首次在上海地區(qū)發(fā)現(xiàn)存在TR46/Y121F/T289A突變位點(diǎn)的煙曲霉菌株;同時(shí),我們還發(fā)現(xiàn)了2株對(duì)唑類耐藥的煙曲霉菌株同時(shí)存在F46Y,G89G,M172V,N248T,D255E的突變位點(diǎn)。結(jié)論本研究中收集自2所教學(xué)醫(yī)院的曲霉菌臨床分離菌株種類主要包括煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、塔賓曲霉、聚多曲霉、溜曲霉、構(gòu)巢曲霉和土曲霉這8個(gè)菌種,煙曲霉仍是優(yōu)勢(shì)致病曲霉菌種。體外抗真菌藥敏試驗(yàn)提示,棘白菌素類藥物對(duì)本次研究收集的曲霉菌株的抗菌活性最高,其次為唑類、多烯類。煙曲霉菌株對(duì)唑類耐藥率有所上升,且相關(guān)耐藥突變位點(diǎn)存在豐富的多樣性,且首次在上海地區(qū)發(fā)現(xiàn)含TR46/Y121F/T289A突變位點(diǎn)的交叉耐藥煙曲霉菌株,提示相關(guān)耐藥菌株存在多種起源及演化途徑,值得真菌病學(xué)、醫(yī)學(xué)真菌學(xué)及流行病學(xué)等領(lǐng)域的學(xué)者警惕,未來在上海地區(qū)就煙曲霉臨床與環(huán)境分離菌株對(duì)唑類藥物的耐藥趨勢(shì)進(jìn)行系統(tǒng)的、長(zhǎng)期的監(jiān)測(cè)研究對(duì)于臨床侵襲性曲霉病的診治是非常必要的。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R446.5
【部分圖文】：

圖 2. ITS、BenA、CaM 基因峰值圖（五） 分子鑒定結(jié)果在 NCBI 官方網(wǎng)站中的核酸 BLAST 中，將上述所有 ITS、BenA、CaM 基因的擴(kuò)增產(chǎn)物序列與 Genbank 數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行比對(duì)分析后結(jié)果顯示：ITS 序列將曲霉菌分類到物種復(fù)合體水平，包含煙曲霉屬 59 株(54.6%)，黃曲霉屬 25 株(23.2%)，黑曲霉屬 20 株(18.5%)，雜色曲霉屬 2 株(A.versicolor complex; 1.9%)，土曲霉屬 1 株(0.9%)，構(gòu)巢曲霉 1 株(0.9%)；除上述常見菌種以外，BenA 基因還鑒定出少見物種株(8.3%)，其中以塔賓曲霉(A. tubingensis; 5.5%, 6/108)為主，其次為聚多曲霉(A.sydowii; 1.9%, 2/108)，溜曲霉(A. tamarii; 0.9%, 1/108)；由 CaM 基因鑒定的少見物種有18株(16.7%)，其中以塔賓曲霉(5.5%, 6/108)為主；其次為新愛耳曲霉(A. neoelliptic3.7%, 4/108)，泡盛曲霉(A. awamori; 2.8%, 3/108)，聚多曲霉(1.9%, 2/108)，A.effusu(1.9%, 2/108)，溜曲霉(0.9%, 1/108)。具體結(jié)果請(qǐng)見表 1、表 2。

曲霉菌ITS基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(續(xù)下)

曲霉菌ITS基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(續(xù)上)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號(hào)：2828020