目的:MicroRNA(微小RNA,miRNA)是一類進化上保守的小非編碼RNA,參與基因表達的調(diào)控并影響多種生物過程,包括細胞分化、免疫反應和腫瘤發(fā)展等。近年來,miRNA已被公認為一種監(jiān)測某些臨床疾病的非侵入性生物標志物,例如已發(fā)現(xiàn)miRNA-21與miRNA-141在晚期前列腺癌患者中高度升高;血漿中miRNA-451和miRNA-486-5p的含量升高,可以在一定程度上提示胃癌;miRNA-124-5p是腫瘤抑制因子,其可作為膠質(zhì)瘤診斷的分子標志物。因此,簡便、靈敏和特異地檢測癌癥相關(guān)的mi RNA,可以為癌癥的早期階段提供有力的依據(jù)。本研究聯(lián)合點擊化學與滾環(huán)擴增(NELRCA)策略構(gòu)建了熒光開關(guān)傳感系統(tǒng),該策略可實現(xiàn)對目標物miRNA-21的靈敏檢測,檢測限低至0.75 fM。同時,這種方法也在未來癌癥的即時診斷和個體化治療中提供一個有意義的生物傳感分析平臺。方法:1.熒光開關(guān)傳感系統(tǒng)的制備:基于點擊化學非酶連接方法和滾環(huán)擴增策略構(gòu)建一種高靈敏的熒光生物傳感器。運用瓊脂糖凝膠電泳、原子力顯微鏡(AFM)、熒光分析技術(shù)等方法對本文應用的氧化石墨烯(GO)材料進行表征及對此傳感系統(tǒng)的可行性進行驗證。2.分析熒光開關(guān)傳感系統(tǒng)的可行性和實驗條件的優(yōu)化:用瓊脂糖凝膠電泳和熒光分析方法驗證傳感系統(tǒng)的可行性;優(yōu)化Cu~(2+)和抗壞血酸的濃度比、Phi29 DNA聚合酶、NELRCA反應時間及孵育溫度、信號探針與GO的相對濃度比等實驗條件。3.傳感系統(tǒng)分析性能評價及目標物的分析檢測:合理評價設(shè)計方法的分析性能,如線性范圍、最低檢測限、特異性等;將miRNA-21作為目標物樣本,其經(jīng)擴增后的產(chǎn)物RCPs在490nm處被激發(fā)下,檢測500nm到600nm的熒光信號強度。結(jié)果:1.用多種方法對點擊化學連接非酶連接和滾環(huán)擴增策略構(gòu)建的熒光開關(guān)傳感系統(tǒng)進行表征和驗證,結(jié)果表明合成的修飾型環(huán)形模板可成功用于目標物的特異性識別和擴增。2.基于NELRCA策略構(gòu)建的熒光開關(guān)傳感系統(tǒng)各項性能:能對低豐度目標物mi RNA-21進行高靈敏檢測;檢測線性范圍在1 fM-1μM;最低檢測限為0.75 fM;分析時間可控制在3小時以內(nèi);特異性良好;本研究方法與其他miRNA檢測方法的分析性能對比,具有較大的優(yōu)勢。結(jié)論:本研究應用點擊化學連接和滾環(huán)擴增策略構(gòu)建用于miRNA分析的熒光開關(guān)傳感系統(tǒng)。該傳感體系中三唑鍵修飾型的環(huán)形模板(MCT)展現(xiàn)出對目標物mi RNA-21的高靈敏、特異性分析性能。研究中,運用多種技術(shù)對合成的MCT和構(gòu)建的NELRCA傳感體系進行表征,證實目標物擴增元件的成功制備。所構(gòu)建的熒光傳感平臺采用先雜交后吸附的檢測程序顯著地簡化了目標物的分析過程。更重要的是,通過合理設(shè)計不同的MCTs以及具有不同熒光團的多種信號探針,可用于后續(xù)研究中多種癌癥相關(guān)生物標志物的多重檢測。此外,本方法與其他檢測方法相比也更具有良好的分析性能。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R446.6
【部分圖文】：

14圖 1 熒光開光系統(tǒng)的制備過程及檢測原理Fig. 1 Schematic illustration of this“off-on”switch system based on nonenzymaticligation-rolling circle amplification for fluorescence sensing of miRNA1.2.2 目標物 miRNA 的分析流程在目標物 miRNA 存在的情況下，其能充當引物并啟動 NELRCA 反應，合成

圖 2 NELRCA 策略的瓊脂糖g. 2 Electrophoresis analysis of this nonenzymatRCA) strategy. Lane 1: FLTs; lane 2: MCTs mixPs band was not observed in the presence of nowas observed in presence of t果與分析熒光開關(guān)系統(tǒng)的可行性驗證 （表征瓊脂糖凝膠電泳表征目標物擴增 NELRC

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文其遷移速率比 FLT（泳道 1）略慢。泳道 3 是由加入 Exo I 進一步檢驗 MCT 是否環(huán)化成功，只有 FLT 通過 CuAAC 反應點擊連接形成三唑鍵后，成功環(huán)形化的 MCT才耐受 Exo I 的降解。泳道 4 是有非目標物 miRNA-141 的情況下，反應體系未觀察到 RCPs 產(chǎn)物。泳道 5 是有目標 miRNA-21 存在的情況下，出現(xiàn)了一條高分子量DNA 產(chǎn)物的模糊條帶。由電泳結(jié)果證實，使用非連接酶合成的環(huán)形模板 MCT 成功地對目標物進行了特異性擴增反應，所提出的 NELRCA 策略為可行。2.2 熒光開關(guān)系統(tǒng)的可行性分析原子力顯微鏡圖像如圖 3顯示，GO 具有單層結(jié)構(gòu)和均勻分散，與參考文獻[25,26]一致。

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本文編號：2827978