目的:MicroRNA(微小RNA,miRNA)是一類進(jìn)化上保守的小非編碼RNA,參與基因表達(dá)的調(diào)控并影響多種生物過程,包括細(xì)胞分化、免疫反應(yīng)和腫瘤發(fā)展等。近年來,miRNA已被公認(rèn)為一種監(jiān)測(cè)某些臨床疾病的非侵入性生物標(biāo)志物,例如已發(fā)現(xiàn)miRNA-21與miRNA-141在晚期前列腺癌患者中高度升高;血漿中miRNA-451和miRNA-486-5p的含量升高,可以在一定程度上提示胃癌;miRNA-124-5p是腫瘤抑制因子,其可作為膠質(zhì)瘤診斷的分子標(biāo)志物。因此,簡(jiǎn)便、靈敏和特異地檢測(cè)癌癥相關(guān)的mi RNA,可以為癌癥的早期階段提供有力的依據(jù)。本研究聯(lián)合點(diǎn)擊化學(xué)與滾環(huán)擴(kuò)增(NELRCA)策略構(gòu)建了熒光開關(guān)傳感系統(tǒng),該策略可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物miRNA-21的靈敏檢測(cè),檢測(cè)限低至0.75 fM。同時(shí),這種方法也在未來癌癥的即時(shí)診斷和個(gè)體化治療中提供一個(gè)有意義的生物傳感分析平臺(tái)。方法:1.熒光開關(guān)傳感系統(tǒng)的制備:基于點(diǎn)擊化學(xué)非酶連接方法和滾環(huán)擴(kuò)增策略構(gòu)建一種高靈敏的熒光生物傳感器。運(yùn)用瓊脂糖凝膠電泳、原子力顯微鏡(AFM)、熒光分析技術(shù)等方法對(duì)本文應(yīng)用的氧化石墨烯(GO)材料進(jìn)行表征及對(duì)此傳感系統(tǒng)的可行性進(jìn)行驗(yàn)證。2.分析熒光開關(guān)傳感系統(tǒng)的可行性和實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化:用瓊脂糖凝膠電泳和熒光分析方法驗(yàn)證傳感系統(tǒng)的可行性;優(yōu)化Cu~(2+)和抗壞血酸的濃度比、Phi29 DNA聚合酶、NELRCA反應(yīng)時(shí)間及孵育溫度、信號(hào)探針與GO的相對(duì)濃度比等實(shí)驗(yàn)條件。3.傳感系統(tǒng)分析性能評(píng)價(jià)及目標(biāo)物的分析檢測(cè):合理評(píng)價(jià)設(shè)計(jì)方法的分析性能,如線性范圍、最低檢測(cè)限、特異性等;將miRNA-21作為目標(biāo)物樣本,其經(jīng)擴(kuò)增后的產(chǎn)物RCPs在490nm處被激發(fā)下,檢測(cè)500nm到600nm的熒光信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)果:1.用多種方法對(duì)點(diǎn)擊化學(xué)連接非酶連接和滾環(huán)擴(kuò)增策略構(gòu)建的熒光開關(guān)傳感系統(tǒng)進(jìn)行表征和驗(yàn)證,結(jié)果表明合成的修飾型環(huán)形模板可成功用于目標(biāo)物的特異性識(shí)別和擴(kuò)增。2.基于NELRCA策略構(gòu)建的熒光開關(guān)傳感系統(tǒng)各項(xiàng)性能:能對(duì)低豐度目標(biāo)物mi RNA-21進(jìn)行高靈敏檢測(cè);檢測(cè)線性范圍在1 fM-1μM;最低檢測(cè)限為0.75 fM;分析時(shí)間可控制在3小時(shí)以內(nèi);特異性良好;本研究方法與其他miRNA檢測(cè)方法的分析性能對(duì)比,具有較大的優(yōu)勢(shì)。結(jié)論:本研究應(yīng)用點(diǎn)擊化學(xué)連接和滾環(huán)擴(kuò)增策略構(gòu)建用于miRNA分析的熒光開關(guān)傳感系統(tǒng)。該傳感體系中三唑鍵修飾型的環(huán)形模板(MCT)展現(xiàn)出對(duì)目標(biāo)物mi RNA-21的高靈敏、特異性分析性能。研究中,運(yùn)用多種技術(shù)對(duì)合成的MCT和構(gòu)建的NELRCA傳感體系進(jìn)行表征,證實(shí)目標(biāo)物擴(kuò)增元件的成功制備。所構(gòu)建的熒光傳感平臺(tái)采用先雜交后吸附的檢測(cè)程序顯著地簡(jiǎn)化了目標(biāo)物的分析過程。更重要的是,通過合理設(shè)計(jì)不同的MCTs以及具有不同熒光團(tuán)的多種信號(hào)探針,可用于后續(xù)研究中多種癌癥相關(guān)生物標(biāo)志物的多重檢測(cè)。此外,本方法與其他檢測(cè)方法相比也更具有良好的分析性能。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R446.6
【部分圖文】：

14圖 1 熒光開光系統(tǒng)的制備過程及檢測(cè)原理Fig. 1 Schematic illustration of this“off-on”switch system based on nonenzymaticligation-rolling circle amplification for fluorescence sensing of miRNA1.2.2 目標(biāo)物 miRNA 的分析流程在目標(biāo)物 miRNA 存在的情況下，其能充當(dāng)引物并啟動(dòng) NELRCA 反應(yīng)，合成

圖 2 NELRCA 策略的瓊脂糖g. 2 Electrophoresis analysis of this nonenzymatRCA) strategy. Lane 1: FLTs; lane 2: MCTs mixPs band was not observed in the presence of nowas observed in presence of t果與分析熒光開關(guān)系統(tǒng)的可行性驗(yàn)證 （表征瓊脂糖凝膠電泳表征目標(biāo)物擴(kuò)增 NELRC

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文其遷移速率比 FLT（泳道 1）略慢。泳道 3 是由加入 Exo I 進(jìn)一步檢驗(yàn) MCT 是否環(huán)化成功，只有 FLT 通過 CuAAC 反應(yīng)點(diǎn)擊連接形成三唑鍵后，成功環(huán)形化的 MCT才耐受 Exo I 的降解。泳道 4 是有非目標(biāo)物 miRNA-141 的情況下，反應(yīng)體系未觀察到 RCPs 產(chǎn)物。泳道 5 是有目標(biāo) miRNA-21 存在的情況下，出現(xiàn)了一條高分子量DNA 產(chǎn)物的模糊條帶。由電泳結(jié)果證實(shí)，使用非連接酶合成的環(huán)形模板 MCT 成功地對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行了特異性擴(kuò)增反應(yīng)，所提出的 NELRCA 策略為可行。2.2 熒光開關(guān)系統(tǒng)的可行性分析原子力顯微鏡圖像如圖 3顯示，GO 具有單層結(jié)構(gòu)和均勻分散，與參考文獻(xiàn)[25,26]一致。

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本文編號(hào)：2827978