脆性X綜合征(fragile X syndrome,FXS)是一種常見的遺傳性智力低下性疾病,其致病基因為脆性X智力障礙1基因(fragile X mental retardation 1 gene,FMR1),編碼脆性 X 智力障礙蛋白(fragile X mental retardation protein,FMRP)。FMR1基因由17個外顯子和16個內(nèi)含子組成,其初始轉(zhuǎn)錄本存在復雜的可變剪接,不同類型的可變剪接變異體可能編碼結(jié)構(gòu)功能各異的FMRP。然而,目前對各種剪接異構(gòu)體的生理功能仍知之甚少。為了研究人外周血FMR1基因可變剪接表達,本研究采用RT-PCR及T克隆-測序技術(shù)檢測了 10份正常人外周血白細胞各可變剪接產(chǎn)物類型并統(tǒng)計其表達豐度,結(jié)果從505個PCR產(chǎn)物-T載體重組質(zhì)粒中共鑒定出50種FMR1基因可變剪接產(chǎn)物,其中包括27種未報道過的新型可變剪接產(chǎn)物。FMR1基因可變剪接產(chǎn)物中表達豐度最高的為ISO 17和ISO 7,兩者均涉及外顯子12的跳躍;其次為ISO1(含有編碼區(qū)全長序列)和IS013(采用外顯子17第二剪接受體位點),其余各類剪接產(chǎn)物出現(xiàn)頻率皆不高于5.0%。本研究檢測出的新型可變剪接產(chǎn)物分別涉及外顯子3、4、11的跳躍,內(nèi)含子7中30bp、87bp片段及內(nèi)含子9中46bp、140bp片段的插入,這提示人FMR1基因的可變剪接產(chǎn)物遠比已知的要復.雜的多。為了探索新型剪接異構(gòu)體的剪接機制,本研究通過公認的剪接位點預測服務器Human Splicing Finder對其剪接位點進行了生物信息學分析,結(jié)果顯示27種新型剪接產(chǎn)物均具備3'剪接受體位點和5'剪接供體位點的剪接信號。為了進一步鑒定本研究中發(fā)現(xiàn)的新型剪接產(chǎn)物IS051～IS053所編碼的蛋白在正常人外周血中存在與否,本研究采用針對其C端氨基酸序列的特異性抗體,通過免疫印跡技術(shù)鑒定人外周血白細胞中該剪接產(chǎn)物的蛋白表達水平,結(jié)果顯示含來自內(nèi)含子9的大小為140bp插入片段的新型轉(zhuǎn)錄本編碼的蛋白在成人外周血中均有可檢測的表達。為了探索FMR1基因可變剪接對FMRP結(jié)構(gòu)及功能的影響,本研究通過服務器I-TASSER構(gòu)建了人FMRP全長蛋白及新型剪接產(chǎn)物IS051-IS053表達的蛋白的結(jié)構(gòu)模型,分別對其部分功能進行了預測,結(jié)果顯示新型轉(zhuǎn)錄本所編碼的FMRP截短蛋白在細胞內(nèi)定位發(fā)生了改變。為了進一步研究該新型剪接異構(gòu)體對相應FMRP生物學功能的影響,本研究運用分子克隆技術(shù)構(gòu)建了含編碼區(qū)全長序列的全長型真核表達載體和一個含新型可變剪接產(chǎn)物IS051的截短型真核表達載體,擬在293T細胞和N2a細胞進行真核表達和過表達研究。本研究不僅豐富了對FMR1基因可變剪接復雜性和多樣性的認識,而且為探討可變剪接對FMRP功能影響、探索FXS發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。
【學位單位】：廈門大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R596;R440
【部分圖文】：

克隆實驗后共挑�。担埃祩�白色菌落，提取質(zhì)粒后進行測序，結(jié)果顯示．？在所送的逡逑５０５個重組質(zhì)粒中，共檢測出５０種人外周血基因的可變剪接產(chǎn)物，剪接產(chǎn)物逡逑編號參照文獻報道［ｎ，１２１，其中，本研宄發(fā)現(xiàn)２７種新型可變剪接異構(gòu)體，如圖１－２逡逑所示，編號ＩＳ０２７－ＩＳ０５３，分別涉及外顯子３、４、１１的跳躍和來自內(nèi)含子７中３０ｂｐ逡逑片段、８７ｂｐ片段及內(nèi)含子９中４６ｂｐ片段、１４０ｂｐ片段的插入，由圖可知大部分新型逡逑剪接產(chǎn)物出現(xiàn)頻率均低于０．６％。逡逑由圖１邋－２、１邋－３可知人外周血■ＦＭ？／基因可變剪接產(chǎn)物中ＩＳＯ邋１７出現(xiàn)的頻率最高，逡逑為２８．５邋％邋（１４４／５０５），涉及外顯子１２及外顯子１７部分片段（５１ｂｐ）的缺失：其次逡逑為ＩＳ０７，占比率為２１．６％（１０９／５０５），僅發(fā)生外顯子１２跳躍；再次為ＩＳ０１邋（含尸嫌／逡逑基因編碼區(qū)全長序列）與ＩＳ０１３邋（采用外顯子１７第二剪接受體位點），兩者所占比逡逑－１４－逡逑

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本文編號：2824799