目的:構(gòu)建以慢病毒為載體的酪氨酸酶(TYR)報告基因,轉(zhuǎn)染SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs),并篩選混合克隆,探討TYR報告基因細胞水平的光聲成像(photoacoustic imaging,PAI)、核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)、以及正電子發(fā)射斷層顯像(positron emission tomography,PET)的可行性。方法:提取SD大鼠股骨骨髓細胞,采用貼壁培養(yǎng)法純化骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCS),流式細胞儀鑒定干細胞特異性抗體CD45和CD90,CD31和CD44。構(gòu)建以慢病毒為載體的TYR報告基因(Lentiviral TYR,LV-TYR)并轉(zhuǎn)染MSCs(MOI=3),嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的混合克隆(TYR-MSCs)作為實驗組,正常MSCs作為陰性對照組。應(yīng)用Western Blot(WB)、酶標儀吸光度檢測法、黑色素Masson-Fontana染色檢測各組細胞目的基因TYR的表達。比較不同組、不同濃度細胞的PAI以及MRI成像結(jié)果。制備黑色素特異性探針18F-5-氟-N-(2-(二乙氨基)乙基)吡啶甲酰胺(18F-5-fluoro-N-(2-(Diethylamino)ethyl)picolinamid,18F-5-FPN),對不同組細胞進行細胞攝取和阻斷實驗。結(jié)果:成功提取并純化SD大鼠MSCs,流式細胞鑒定CD90和CD44陽性,CD45和CD31陰性。LV-TYR成功轉(zhuǎn)染MSCs,嘌呤霉素篩選混合克隆。Western Blot、酶標儀吸光度檢測法、黑色素Masson-Fontana染色顯示TYR-MSCs能表達目的基因TYR,而MSCs無TYR表達。TYR-MSCs組有明顯的PAI信號,加酪氨酸(tyrosine)預(yù)處理的TYR-MSCs的PAI信號較未預(yù)處理的TYR-MSCs信號強。MRI細胞顯像顯示加三氯化鐵(FeCl3)或Tyrosine預(yù)處理的TYR-MSCs顯示了較高的T1信號,且信號的強度隨細胞濃度的增加而增加。同時加FeCl3和Tyrosine的TYR-MSCs組T1信號最強。加FeCl3的MSCs組T1信號有輕度增加。細胞攝取實驗結(jié)果表明TYR-MSCs對18F-5-FPN的攝取在60min時最高,細胞攝取值為7.86±0.85%(n=3),阻斷實驗表明,19F-5-FPN能阻斷細胞攝取18F-5-FPN。結(jié)論:本研究通過慢病毒為載體轉(zhuǎn)染TYR報告基因至大鼠MSCs并構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TYR的MSCs細胞系。通過對TYR-MSCs進行PAI、MRI顯像以及核素細胞攝取實驗,從體外細胞水平證實轉(zhuǎn)染TYR的MSCs可以進行多模態(tài)顯像,為干細胞在體示蹤提供了理論基礎(chǔ)。目的:探索應(yīng)用TYR單一報告基因進行在體正電子發(fā)射斷層顯像(positron emission tomography,PET)、核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)、以及光聲成像(photoacoustic imaging,PAI)以監(jiān)測心肌梗死模型干細胞移植的可行性。方法:采用左側(cè)開胸結(jié)扎SD大鼠左冠狀動脈建立永久性心梗模型,結(jié)扎后半小時在心梗區(qū)周圍注射大鼠攜帶TYR報告基因的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(TYR-MSCs),以相同方法注射未轉(zhuǎn)染的MSCs作為對照組。72 h后處死部分大鼠行心肌細胞HE染色以及心臟TTC染色。當天、第6 d、第13 d、第20 d、第27 d行18F-FDG心肌代謝顯像鑒定建模成功率。建模后第1 d、第7 d、第14 d、第21 d、第28 d行18F-5-FPN探針的PET成像、MRI成像以及光聲成像活體示蹤干細胞。結(jié)果:結(jié)扎冠脈法建模成功率為70%,HE染色可見心梗區(qū)域心肌細胞壞死、水腫、變性、空泡形成、心肌纖維斷裂以及淋巴細胞浸潤等。正常心肌細胞排列整齊,血管豐富。TTC染色可見梗死區(qū)域心肌呈白色,平均梗死面積為38.1%±7.3%(n=3)。18F-FDG心肌代謝顯像可見心梗區(qū)域有放射性分布缺損。18F-5-FPN PET成像可見干細胞移植區(qū)有明顯局限放射性分布濃聚,其隨時間延長放射性分布輕度減低,第1d至第28d從1.78±0.22%ID/g下降至1.62±0.13%ID/g(n=8),無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。MRI顯像T2*WI序列成像可見干細胞移植區(qū)信號減低,心梗區(qū)域和周圍正常心肌的對比度逐漸增加,第1 d至第28 d對比度從59.18±4.9增加至80.5±8.8(n=8),有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。光聲成像可見干細胞移植區(qū)明顯光聲信號,但是信號值第1 d至第28 d從472.6±48.1下降至283.4±49.2,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:TYR報告基因可用于活體PET、MRI和PAI多模態(tài)顯像以示蹤干細胞,在體顯像顯示移植了TYR-MSCs的大鼠心梗區(qū)域在28 d內(nèi)均有PET、MRI、PAI信號。但MRI信號和PAI信號隨時間衰減明顯,PET信號衰減不明顯。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R542.22;R445.2
【部分圖文】：

圖 1：酪氨酸酶的催化反應(yīng)以及催化產(chǎn)物黑色素用于多模態(tài)顯像的原理急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是指因持久和嚴重的心肌缺引起的部分心肌急性壞死，是一類患病率及死亡率均較高的缺血性心臟病。其病理改變主要表現(xiàn)為心肌細胞壞死、凋亡細胞數(shù)增加、心肌細胞纖維化、瘢痕形成。隨著病變的進展，逐步出現(xiàn)心室重構(gòu)、心臟擴大、心臟收縮功能減低、最終導(dǎo)致心臟功能衰竭[28]。目前急性心肌梗死常見治療手段包括藥物治療、經(jīng)皮冠狀動脈介入（PCI）和冠狀動脈旁路移植術(shù)（GABG），但這些治療手段只能挽救瀕死的心肌，對已死亡的心肌細胞沒有治療作用[29]。目前心肌梗死治療的主要困難在于心肌細胞再生和血管重建。近年來的研究表明，具有再生潛能的干細胞或祖細胞，尤其是體細胞來源的誘導(dǎo)多能干細胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）為心肌再生提供了一種可能[30]Takuya Narita[31]的統(tǒng)計表明，在一系列干細胞治療心力衰竭動物實驗成功的基礎(chǔ)上，已有 40 余項干細胞治療心力衰竭的臨床實驗獲得注冊。目前已完成的臨床實驗結(jié)果

17圖 2：載體 GV341 圖譜用DNA連接酶連接載體和TYR基因，將TYR基因克隆到載體中。用熱休克法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌E1Coli DH5α，經(jīng)嘌呤霉素抗性篩落。接入800 μL溶湯肉菌（LB）培養(yǎng)基中37℃搖床振蕩培養(yǎng)24 h，小量提取試劑盒提取質(zhì)粒。PCR法、酶切法篩選正確的重組質(zhì)粒，測序鑒定載體構(gòu)建完全正確

圖 3：病毒液濾過收集置于轉(zhuǎn)頭上在4000 g離心10~15 min，得到濃縮，取出離心裝置，分離過濾杯和濾過液收集杯于1000 g的離心力離心2 min，樣品收集杯中的圖 4：病毒液濃縮液移至病毒管中，-80 °C長期保持，并進行病檢測病毒滴度

【參考文獻】

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本文編號：2825027