膿毒癥是由宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)引起的一種危機生命的器官功能障礙,每年會影響全世界數(shù)百萬人且病死率高達25%,已成為引起死亡的十大病因之一~([1,2])。過度的氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)被認(rèn)為是膿毒癥所致多器官功能障礙的重要原因,其中肺臟是膿毒癥中最易受損的靶器官之一~([3])。而在膿毒癥肺損傷所涉及的靶細(xì)胞中,肺泡上皮細(xì)胞是重要的靶效應(yīng)細(xì)胞,肺泡中性粒細(xì)胞(PMN)、肺泡巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞會粘附于肺泡上皮細(xì)胞表面并釋放大量活性氧(ROS)以及其他炎性介質(zhì)使肺泡上皮細(xì)胞受損,從而破壞肺內(nèi)機械屏障,導(dǎo)致大量炎性因子涌入,進而加重肺損傷~([4,5])。線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器,除了能夠產(chǎn)生ATP外,還在細(xì)胞程序性死亡的調(diào)控、免疫炎性反應(yīng)、鈣信號傳遞以及脂肪酸氧化中發(fā)揮重要作用~([6])。同時,線粒體作為一種動態(tài)的細(xì)胞器,能通過線粒體動力學(xué)作用改變其在細(xì)胞內(nèi)的大小、形狀、位置和功能,氧自由基作用在線粒體會致使線粒體融合減少,影響線粒體功能,進而會損害細(xì)胞的長期生存能力~([7])。在哺乳動物中,調(diào)節(jié)線粒體融合的蛋白包括線粒體融合蛋白1(mitofusin,Mfn1)、線粒體融合蛋白2(mitofusin,Mfn2)和視神經(jīng)萎縮蛋白1(optic atrophy protein 1,OPA1),其中Mfn1、2是定位于線粒體外膜的蛋白而OPA1定位于線粒體內(nèi)膜~([8])。研究表明,在培養(yǎng)的細(xì)胞和小鼠組織中,融合蛋白的缺失會導(dǎo)致線粒體網(wǎng)絡(luò)嚴(yán)重斷裂,線粒體與線粒體之間的物質(zhì)交換被終止,線粒體DNA含量顯著下降,Mfn1和Mfn2功能的喪失導(dǎo)致線粒體代謝功能改變、膜電位喪失并降低線粒體呼吸功能,敲除OPA1會使線粒體膜電位廣泛喪失并減少基礎(chǔ)呼吸速率~([8,9])。血紅素加氧酶-1(HO-1)是一種由ROS和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)酶,能夠催化血紅素降解為一氧化碳、膽綠素和游離鐵,在抑制和調(diào)節(jié)機體組織器官炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡和增殖過程中發(fā)揮著重要作用~([10])。我們前期的研究表明,在LPS攻擊大鼠模型中,HO-1上調(diào)可促進線粒體融合,但其機制尚不明確~([11,12])。p38MAPK作為絲裂原活化蛋白激酶亞族之一是信息轉(zhuǎn)導(dǎo)的紐帶,可以被細(xì)胞外的炎性刺激等因素激活,激活后的p38MAPK通路可調(diào)動機體內(nèi)源性抗炎能力,誘導(dǎo)細(xì)胞HO-1表達,調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老、凋亡、細(xì)胞炎癥及其氧化應(yīng)激,在減輕急性肺損傷的炎性反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用~([13,14])。目前尚無p38MAPK介導(dǎo)HO-1表達對LPS攻擊大鼠肺泡II型上皮細(xì)胞中線粒體融合影響的相關(guān)報道。目的探討p38分裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)介導(dǎo)血紅素加氧酶1(HO-1)表達對脂多糖(LPS)攻擊大鼠肺泡II型上皮細(xì)胞中線粒體融合的作用。方法將大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞以1x10~6個/ml密度接種于6孔板。采用隨機數(shù)字表法分為7組:空白對照組(C組)、LPS攻擊模型組(L組)、LPS+CO釋放劑CORM-2組(LC組)、LPS+p38MAPK抑制劑SB203580組(LS組)、LPS+DMSO組(LD組)、CORM-2組(CO組)和SB203580組(S組)。C組正常培養(yǎng)細(xì)胞;L組給予10μg/ml LPS;LC組于加入LPS前30 min給予CORM-2100μM;LS組和LD組于加入LPS前1 h分別給予SB203580 10μM和0.1%DMSO 100μM;CO組、S組分別加入CORM-2 100μM、SB203580 10μM。細(xì)胞孵育24 h后,采用MTT法檢測細(xì)胞活力、硫代巴比妥酸法測定培養(yǎng)液丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量、黃嘌呤氧化酶法測定培養(yǎng)液(Superoxide Dismutase,SOD)活性,采用ELISA法測定細(xì)胞上清液腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)的水平,采用Western blot法測定p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)、血紅素加氧酶-1(HO-1)、線粒體融合蛋白1(Mfn1)、線粒體融合蛋白2(Mfn2)和視神經(jīng)萎縮蛋白1(OPA1)的表達水平。結(jié)果與C組、CO組、S組相比,其余各組MDA含量升高,SOD活性降低,TNF-α、IL-6水平升高,細(xì)胞活力降低,p-p38和HO-1表達上調(diào),Mfn1、Mfn2、OPA1表達下調(diào)(P0.05);與L組相比,LC組MDA含量降低,SOD活性升高,TNF-α、IL-6水平降低,細(xì)胞活力升高,p-p38、HO-1、Mfn1、Mfn2和OPA1表達上調(diào)(P0.05),而LS組MDA含量升高,SOD活性降低,TNF-α、IL-6水平升高,細(xì)胞活力降低,p-p38、HO-1、Mfn1、Mfn2、OPA1表達下調(diào)(P0.05);與LC組相比,LS組MDA含量升高,SOD活性降低,TNF-α、IL-6水平升高,細(xì)胞活力降低,p-p38、HO-1、Mfn1、Mfn2、OPA1表達下調(diào)(P0.05)。且C組、CO組、S組間,L組和LD組間上述各指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),各組間總p38蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論HO-1可促進LPS攻擊大鼠肺泡II型上皮細(xì)胞中線粒體融合,其機制可能與p38MAPK信號通路有關(guān)。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R459.7
【部分圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文冰乙酸 12.6ml、硼酸 7.5g 混合溶解，并加水定容至 1000ml 置于室溫保存。（16） 配制電轉(zhuǎn)液緩沖液：取 Tris 堿 3.035g、甘氨酸 14.4g、200ml 甲醇放入燒杯中，倒入去離子水添加至 1000ml，充分?jǐn)嚢枞芙狻?.5 實驗方法如下圖所示流程處理以 LPS、CORM-2、SB203580 和 DMSO 處理 RLE-6TN細(xì)胞，各組處理結(jié)束后，繼續(xù)孵育細(xì)胞 24h，采用 MTT 法檢測各組細(xì)胞活力，并取各組上清液測定炎癥因子（TNF- 和 IL-6）及氧化應(yīng)激指標(biāo)（MDA 含量和SOD 活性），隨后通過 westernblot 檢測各組細(xì)胞中 HO-1、Mfn1、Mfn2、OPA1、p38 以及 p-p38 的表達水平。

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本文編號：2820841