膿毒癥是由宿主對感染的反應失調引起的一種危機生命的器官功能障礙,每年會影響全世界數(shù)百萬人且病死率高達25%,已成為引起死亡的十大病因之一~([1,2])。過度的氧化應激及炎性反應被認為是膿毒癥所致多器官功能障礙的重要原因,其中肺臟是膿毒癥中最易受損的靶器官之一~([3])。而在膿毒癥肺損傷所涉及的靶細胞中,肺泡上皮細胞是重要的靶效應細胞,肺泡中性粒細胞(PMN)、肺泡巨噬細胞等炎性細胞會粘附于肺泡上皮細胞表面并釋放大量活性氧(ROS)以及其他炎性介質使肺泡上皮細胞受損,從而破壞肺內(nèi)機械屏障,導致大量炎性因子涌入,進而加重肺損傷~([4,5])。線粒體是細胞內(nèi)重要的細胞器,除了能夠產(chǎn)生ATP外,還在細胞程序性死亡的調控、免疫炎性反應、鈣信號傳遞以及脂肪酸氧化中發(fā)揮重要作用~([6])。同時,線粒體作為一種動態(tài)的細胞器,能通過線粒體動力學作用改變其在細胞內(nèi)的大小、形狀、位置和功能,氧自由基作用在線粒體會致使線粒體融合減少,影響線粒體功能,進而會損害細胞的長期生存能力~([7])。在哺乳動物中,調節(jié)線粒體融合的蛋白包括線粒體融合蛋白1(mitofusin,Mfn1)、線粒體融合蛋白2(mitofusin,Mfn2)和視神經(jīng)萎縮蛋白1(optic atrophy protein 1,OPA1),其中Mfn1、2是定位于線粒體外膜的蛋白而OPA1定位于線粒體內(nèi)膜~([8])。研究表明,在培養(yǎng)的細胞和小鼠組織中,融合蛋白的缺失會導致線粒體網(wǎng)絡嚴重斷裂,線粒體與線粒體之間的物質交換被終止,線粒體DNA含量顯著下降,Mfn1和Mfn2功能的喪失導致線粒體代謝功能改變、膜電位喪失并降低線粒體呼吸功能,敲除OPA1會使線粒體膜電位廣泛喪失并減少基礎呼吸速率~([8,9])。血紅素加氧酶-1(HO-1)是一種由ROS和細胞因子誘導的應激反應酶,能夠催化血紅素降解為一氧化碳、膽綠素和游離鐵,在抑制和調節(jié)機體組織器官炎癥、氧化應激、凋亡和增殖過程中發(fā)揮著重要作用~([10])。我們前期的研究表明,在LPS攻擊大鼠模型中,HO-1上調可促進線粒體融合,但其機制尚不明確~([11,12])。p38MAPK作為絲裂原活化蛋白激酶亞族之一是信息轉導的紐帶,可以被細胞外的炎性刺激等因素激活,激活后的p38MAPK通路可調動機體內(nèi)源性抗炎能力,誘導細胞HO-1表達,調節(jié)細胞衰老、凋亡、細胞炎癥及其氧化應激,在減輕急性肺損傷的炎性反應中發(fā)揮著重要的作用~([13,14])。目前尚無p38MAPK介導HO-1表達對LPS攻擊大鼠肺泡II型上皮細胞中線粒體融合影響的相關報道。目的探討p38分裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)介導血紅素加氧酶1(HO-1)表達對脂多糖(LPS)攻擊大鼠肺泡II型上皮細胞中線粒體融合的作用。方法將大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞以1x10~6個/ml密度接種于6孔板。采用隨機數(shù)字表法分為7組:空白對照組(C組)、LPS攻擊模型組(L組)、LPS+CO釋放劑CORM-2組(LC組)、LPS+p38MAPK抑制劑SB203580組(LS組)、LPS+DMSO組(LD組)、CORM-2組(CO組)和SB203580組(S組)。C組正常培養(yǎng)細胞;L組給予10μg/ml LPS;LC組于加入LPS前30 min給予CORM-2100μM;LS組和LD組于加入LPS前1 h分別給予SB203580 10μM和0.1%DMSO 100μM;CO組、S組分別加入CORM-2 100μM、SB203580 10μM。細胞孵育24 h后,采用MTT法檢測細胞活力、硫代巴比妥酸法測定培養(yǎng)液丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量、黃嘌呤氧化酶法測定培養(yǎng)液(Superoxide Dismutase,SOD)活性,采用ELISA法測定細胞上清液腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)的水平,采用Western blot法測定p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)、血紅素加氧酶-1(HO-1)、線粒體融合蛋白1(Mfn1)、線粒體融合蛋白2(Mfn2)和視神經(jīng)萎縮蛋白1(OPA1)的表達水平。結果與C組、CO組、S組相比,其余各組MDA含量升高,SOD活性降低,TNF-α、IL-6水平升高,細胞活力降低,p-p38和HO-1表達上調,Mfn1、Mfn2、OPA1表達下調(P0.05);與L組相比,LC組MDA含量降低,SOD活性升高,TNF-α、IL-6水平降低,細胞活力升高,p-p38、HO-1、Mfn1、Mfn2和OPA1表達上調(P0.05),而LS組MDA含量升高,SOD活性降低,TNF-α、IL-6水平升高,細胞活力降低,p-p38、HO-1、Mfn1、Mfn2、OPA1表達下調(P0.05);與LC組相比,LS組MDA含量升高,SOD活性降低,TNF-α、IL-6水平升高,細胞活力降低,p-p38、HO-1、Mfn1、Mfn2、OPA1表達下調(P0.05)。且C組、CO組、S組間,L組和LD組間上述各指標比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),各組間總p38蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論HO-1可促進LPS攻擊大鼠肺泡II型上皮細胞中線粒體融合,其機制可能與p38MAPK信號通路有關。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R459.7
【部分圖文】：

天津醫(yī)科大學碩士學位論文冰乙酸 12.6ml、硼酸 7.5g 混合溶解，并加水定容至 1000ml 置于室溫保存。（16） 配制電轉液緩沖液：取 Tris 堿 3.035g、甘氨酸 14.4g、200ml 甲醇放入燒杯中，倒入去離子水添加至 1000ml，充分攪拌溶解。1.5 實驗方法如下圖所示流程處理以 LPS、CORM-2、SB203580 和 DMSO 處理 RLE-6TN細胞，各組處理結束后，繼續(xù)孵育細胞 24h，采用 MTT 法檢測各組細胞活力，并取各組上清液測定炎癥因子（TNF- 和 IL-6）及氧化應激指標（MDA 含量和SOD 活性），隨后通過 westernblot 檢測各組細胞中 HO-1、Mfn1、Mfn2、OPA1、p38 以及 p-p38 的表達水平。

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 ;中國醫(yī)藥城首批融合蛋白試劑出口[J];泰州科技;2010年08期

2 李東巧;陳芳;Cynthia Liu;Yingzhu Li;Yi Deng;韓濤;余敏;楊艷萍;王學昭;;全球融合蛋白藥物研發(fā)態(tài)勢分析[J];中國生物工程雜志;2019年05期

3 KahYong Goh;Lufang Zhou;練桂麗;;線粒體融合蛋白與心血管疾病[J];中華高血壓雜志;2014年10期

4 徐富勇;孟瑋;劉仁榮;徐玲;裘雪梅;朱立鑫;;脫氧雪腐鐮刀菌烯醇模擬表位的2種融合蛋白的表達及其在無毒酶聯(lián)免疫吸附方法中的應用[J];食品科學;2014年08期

5 李獻帥;穆軍升;;線粒體融合蛋白1、線粒體融合蛋白2與心肌細胞生理機能關系的研究進展[J];中國胸心血管外科臨床雜志;2013年04期

6 沈波;傅鷹;孟哲峰;徐巍;何小帆;朱敏;;融合蛋白CXCL10-loop3-EGF的可溶性表達及其抗腫瘤效應研究[J];中國病理生理雜志;2009年12期

7 汪建華;融合蛋白技術的應用[J];陜西醫(yī)學雜志;2004年12期

8 楊和平，黃宗之;融合蛋白的生產(chǎn)技術[J];中國動脈硬化雜志;1994年04期

9 黃培堂;W.K.Maas;;表達具有熱穩(wěn)定腸毒素Ⅱ免疫原性融合蛋白菌株的構建[J];生物工程學報;1988年04期

10 蔡仕英,馬賢凱;提純性融合蛋白[J];生物工程進展;1988年04期

相關會議論文 前10條

1 姜文國;張樹平;;基于4-1BBL的雙功能融合蛋白的構建及比較[A];2009醫(yī)學前沿論壇暨第十一屆全國腫瘤藥理與化療學術會議論文集[C];2009年

2 孫益;葛霽光;;人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子和可溶性人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子受體的融合蛋白的表達[A];中國生物醫(yī)學工程學會第六次會員代表大會暨學術會議論文摘要匯編[C];2004年

3 高基民;呂建新;;白細胞介素15/鏈親和素融合蛋白的制備及活性測定[A];中國遺傳學會第八次代表大會暨學術討論會論文摘要匯編（2004-2008）[C];2008年

4 李鳳杰;張蓉;胡長鵬;冉茜;向陽;相麗欣;陳立;肖燕妮;李忠俊;;急性輻射損傷防治藥物制劑IL-12/Fc融合蛋白的藥效學、藥理學和毒理學研究[A];中國毒理學會第七次全國會員代表大會暨中國毒理學會第六次中青年學者科技論壇論文摘要[C];2018年

5 楊振泉;劉巧泉;于恒秀;潘志明;焦新安;;新城疫病毒融合蛋白在轉基因水稻葉片中的表達及其免疫原性[A];中國畜牧獸醫(yī)學會畜牧獸醫(yī)生物技術學分會暨中國免疫學會獸醫(yī)免疫分會第六次研討會論文集[C];2005年

6 楊振泉;劉巧泉;于恒秀;潘志明;焦新安;;新城疫病毒融合蛋白在轉基因水稻葉片中的表達及其免疫原性[A];中國生物工程學會第四次會員代表大會暨學術討論會論文摘要集[C];2005年

7 王蘭;王德仲;楊晶;官麗莉;王艷芳;劉秀明;夏繼橋;李海燕;姜潮;李校X;;擬南芥表達植物油體蛋白-角質細胞生長因子-2融合蛋白的研究[A];2013全國植物生物學大會論文集[C];2013年

8 陳麗華;王強;侯萬國;;不同鏈接劑修飾的融合谷胱甘肽活性的研究[A];中國化學會第十二屆膠體與界面化學會議論文摘要集[C];2009年

9 丁來豐;王玉蘭;;一種融合蛋白對黑素瘤移植小鼠代謝組影響的研究[A];2018第二十屆全國波譜學學術年會會議論文摘要集[C];2018年

10 孫翠蓮;潘建平;;sflk1-IFN-γ融合蛋白的分離與純化[A];浙江省免疫學會第六次學術研討會論文匯編[C];2007年

相關重要報紙文章 前10條

1 記者 曹麗君;新型抗流感藥物有望治療非典等病[N];新華每日電訊;2003年

2 通訊員 沈季 記者 張兆軍;抗腫瘤融合蛋白進入臨床試驗[N];科技日報;2005年

3 記者 朱敏麗　通訊員 潘越;中國醫(yī)藥城首批融合蛋白試劑出口[N];泰州日報;2010年

4 常麗君;線粒體融合蛋白2決定細胞生死[N];科技日報;2013年

5 吳紅梅;我省首批融合蛋白試劑出口美國[N];新華日報;2010年

6 金陵;融合蛋白試劑首次出口美國[N];中國醫(yī)藥報;2010年

7 本報特約撰稿 吳文君;抗體藥與融合蛋白藥物兩大高速擴容地帶[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2016年

8 記者 張曄　通訊員 劉寧春;一種有效治療冠心病的融合蛋白發(fā)現(xiàn)[N];科技日報;2009年

9 毛磊;新型抗流感藥物有望面世[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2003年

10 馮衛(wèi)東;抑制蛋白相互作用可成為治癌新方法[N];科技日報;2009年

相關博士學位論文 前10條

1 羅剛;畢赤酵母表達重組豬促卵泡素的研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2019年

2 吉福志;融合蛋白anti-EGFR-iRGD對胃癌放療增敏作用與機制[D];南京醫(yī)科大學;2018年

3 茹毅;重組HSA/dTMP融合蛋白在哺乳動物細胞中的高效表達及其活性研究[D];蘭州大學;2016年

4 王梅竹;TAT-HSA-α-MSH融合蛋白的酵母表達及抑制中樞神經(jīng)炎癥的研究[D];蘭州大學;2016年

5 李玉龍;融合蛋白PML-RARα對NRF2信號通路的調控及機理研究[D];浙江大學;2016年

6 殷艷婷;B類G蛋白偶聯(lián)受體的結構與功能研究[D];中國科學院大學(中國科學院上海藥物研究所);2017年

7 王維敏;長效Fc-apelin-13融合蛋白對高脂飲食誘導的肥胖小鼠肝臟及心臟的保護作用[D];南京醫(yī)科大學;2018年

8 王海波;m_4AchR-Gilα融合蛋白的表達及功能的研究[D];中國醫(yī)科大學;2004年

9 蔣衛(wèi)民;HIV-1 p24和gp41融合基因載體的構建以及融合蛋白在原核細胞中的表達[D];復旦大學;2004年

10 張意;酵母表達的MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白的生物學功及其相關機制研究[D];第二軍醫(yī)大學;2005年

相關碩士學位論文 前10條

1 安晨;主動免疫INH-α、AMH和PRL融合蛋白對浙東白鵝產(chǎn)蛋及就巢性狀的影響[D];揚州大學;2019年

2 沈伊勤;單克隆抗體聚體與碎片的去除與純度檢測方法的優(yōu)化[D];上海交通大學;2018年

3 張嬌;線粒體融合蛋白2在小鼠角膜形態(tài)發(fā)育中的作用[D];中國醫(yī)科大學;2019年

4 杜詩涵;p38MAPK信號通路介導HO-1表達對LPS攻擊大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞模型中線粒體融合蛋白的影響[D];天津醫(yī)科大學;2019年

5 王娜;重組促血小板生成素模擬肽-人血清白蛋白融合蛋白的分離純化及穩(wěn)定性研究[D];蘭州大學;2017年

6 汪坤;新蛭素與人IgG-Fc融合蛋白的表達純化和功能評價[D];天津大學;2018年

7 張素婷;融合蛋白ΔA146Ply-SP0148經(jīng)黏膜途徑免疫對小鼠肺炎鏈球菌感染的保護效應研究[D];遵義醫(yī)科大學;2019年

8 王阿香;anti-PD-1/IL-15/IL-15Rα雙功能融合蛋白的制備及其生物學功能研究[D];鄭州大學;2019年

9 韓樂;IgD-Fc-Ig融合蛋白對大鼠膠原性關節(jié)炎治療作用及對T細胞IgD-IgDR-Lck-NF-κB信號通路調控[D];安徽醫(yī)科大學;2019年

10 趙東偉;人hAPRIL-Fc、hBAFF-Fc融合蛋白的原核高效表達、純化及功能鑒定[D];南京師范大學;2015年

本文編號：2820841