目的:2013年5月8日,國務(wù)院總理李克強(qiáng)在國務(wù)院常務(wù)會(huì)議中特別提出“嚴(yán)厲打擊肉類產(chǎn)品摻假售假等違法違規(guī)行為”。從2013年1月歐洲馬肉事件到近期報(bào)道的鼠肉冒充羊肉串和狐貍?cè)饷俺渑Ｑ蛉獾鹊?“摻假肉”不停地沖擊著肉品市場,帶來了巨大的負(fù)面影響。其中最值得關(guān)注的是摻雜鼠肉、狐貍?cè)�、貉子肉和貂肉。由于在飼養(yǎng)皮毛動(dòng)物的過程中缺乏嚴(yán)格的檢疫程序,其肉源可能攜帶大量細(xì)菌、病毒、寄生蟲及過敏源。此外,為了保證皮毛的質(zhì)量,喂養(yǎng)皮毛動(dòng)物的飼料中含有大量的重金屬、激素、抗菌素以及抗病毒藥物等物質(zhì),造成此類肉源內(nèi)有毒有害物質(zhì)嚴(yán)重超標(biāo),食用此類肉源將會(huì)對(duì)人的健康產(chǎn)生巨大的危害。在監(jiān)管鼠、狐貍、貉子和貂肉源性成分方面,我國面臨的三個(gè)困境。第一,雖然我們必須嚴(yán)格遵守我國行政法規(guī)和法律依據(jù)實(shí)施監(jiān)管,但是目前我國并沒有明確的法律規(guī)定鼠肉、狐貍?cè)狻⒑炎尤�、貂肉等不得食用。第�?雖然食品監(jiān)管部門應(yīng)該對(duì)此種肉類摻假問題進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)管,但是我國摻雜肉鑒別檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)存在著較大空白,尤其像鼠、狐、貉和貂這些特殊的肉源成分。目前,我國尚無統(tǒng)一的檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn),且在現(xiàn)有檢測(cè)其他肉源性成分的標(biāo)準(zhǔn)體系中也沒有可以同時(shí)檢測(cè)多種源性成分的檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)。第三,由于肉類產(chǎn)品具有流通量大和保質(zhì)期短等特點(diǎn),在實(shí)驗(yàn)室條件下常用的定量和定性檢測(cè)方法很難滿足實(shí)時(shí)的、快速的、大批量產(chǎn)品檢測(cè)的需求,因此亟待開發(fā)出高通量、快速、便捷、準(zhǔn)確的肉源性成分的快速檢測(cè)技術(shù)及產(chǎn)品。本論文基于國家食品監(jiān)管的完善和肉品市場的檢測(cè)需求,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的快速核酸識(shí)別技術(shù)優(yōu)勢(shì),以鼠、狐貍、貉子、貂肉源性成分為研究對(duì)象,開展了肉源性成分快速檢測(cè)技術(shù)的研究與應(yīng)用。方法:1、本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)確定了具有特異性的核酸序列,用以作為檢測(cè)的基因靶點(diǎn)。2、利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0、DNAMAN和Primer Explorer V4,設(shè)計(jì)了一系列的引物,并對(duì)其特異性進(jìn)行了篩選和驗(yàn)證。3、利用動(dòng)物血液/細(xì)胞/組織DNA提取試劑盒提取靶基因的DNA。4、利用紫外-可見光譜確定DNA含量。5、利用瓊脂糖凝膠電泳分析了PCR、MPCR、LAMP、RCA擴(kuò)增產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物。6、利用等溫環(huán)介導(dǎo)方法篩選擴(kuò)增引物,并對(duì)影響LAMP反應(yīng)的主要因素進(jìn)行了單因素考察,確定最佳LAMP反應(yīng)體系。7、利用滾環(huán)復(fù)制擴(kuò)增(RCA)方法對(duì)設(shè)計(jì)的識(shí)別探針的特異性和有效性進(jìn)行篩選。8、利用正交實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)化DNAzyme過氧化發(fā)光信號(hào)放大體系實(shí)驗(yàn)條件。結(jié)果:1、建立了檢測(cè)鼠、狐貍、貉子、貂肉源性成分的PCR和多重PCR的方法。通過GeneBlast比對(duì),設(shè)計(jì)并篩選出了四對(duì)鼠、狐貍、貉子、貂特異性引物,獲得了分別為285bp、744bp、622bp和395bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。利用DNA基因測(cè)序和限制性核酸內(nèi)切酶驗(yàn)證了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。測(cè)序結(jié)果與GeneBank收錄的序列具有高于98%的序列同源性,從而建立了用于檢測(cè)鼠、狐貍、貉子、貂肉源性成分的四種PCR方法和PCR-RFLP方法。運(yùn)用上述四對(duì)引物和文獻(xiàn)報(bào)道的用于牛肉源性成分檢測(cè)的PCR引物和用于羊肉源性成分檢測(cè)的PCR引物,開發(fā)出了檢測(cè)牛肉中和羊肉中摻雜鼠、狐貍、貉子、貂肉源性成分的2重、3重和4重PCR檢測(cè)方法。該方法可在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)多種肉源性成分,實(shí)現(xiàn)了高通量快速檢測(cè),檢出限不低于1%(w/w),可以滿足現(xiàn)場檢測(cè)的要求。2、建立了檢測(cè)鼠源性成分的新型LAMP方法。通過GeneBlast比對(duì),篩選出鼠的特異性基因片段;針對(duì)該片段設(shè)計(jì)了LAMP引物并進(jìn)行改進(jìn),利用熒光定量檢測(cè)和熒光目測(cè)比色法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)。通過優(yōu)化引物特異性、引物比例、引物濃度、模板濃度等反應(yīng)條件,從4組引物中成功篩選出了1組鼠源性成分的等溫?cái)U(kuò)增引物。在優(yōu)化的條件下(反應(yīng)溫度為63℃,引物比例為1:2:8摩爾比,模板濃度為2~5ng/μL),該方法的檢出限不低于1%(w/w)。采用同樣方法,從4組套狐貍源性成分LAMP引物中成功篩選出了1組狐貍源性成分的LAMP引物。在優(yōu)化的條件下(反應(yīng)溫度為63℃,引物比例為1:3:10摩爾比,模板濃度為2~5ng/μL),該引物出現(xiàn)檢測(cè)閾值時(shí)間仍大于30min,表明LAMP引物結(jié)構(gòu)需要進(jìn)一步優(yōu)化。采用同樣方法對(duì)3組貉子和2組貂,源性成分的LAMP引物進(jìn)行了篩選。但是,沒有獲得理想的貉子和貂源性成分的LAMP引物。3、建立了檢測(cè)鼠肉源性成分的RCA方法。通過GeneBlast分析,確定了鼠的16s核糖體亞基的特異性片段作為靶標(biāo)片段,并針對(duì)該靶標(biāo)片段設(shè)計(jì)了RCA鎖式探針。以鼠源性成分的S系列鎖式探針為基礎(chǔ),對(duì)環(huán)化連接酶進(jìn)行了篩選,考察了T4 DNA連接酶、連接時(shí)間、鎖式探針結(jié)構(gòu)、目標(biāo)基因片段切割點(diǎn)、靶標(biāo)片段點(diǎn)突變對(duì)RCA擴(kuò)增效率的影響。此外,本實(shí)驗(yàn)還考察了phi29 DNA聚合酶擴(kuò)增體系和Bst DNA聚合酶擴(kuò)增體系的檢測(cè)效率,考察了隨機(jī)引物長度對(duì)RCA擴(kuò)增效率的影響,并最終確定了該檢測(cè)體系的最適條件。在此基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)利用RCA體系篩選了S系列、RC體系和FC體系的鼠肉源性成分識(shí)別鎖式探針。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,所設(shè)計(jì)的鎖式探針具有很高的識(shí)別效率,并得到了酶切反應(yīng)的驗(yàn)證,為鼠肉源性成分的RCA快速鑒別奠定技術(shù)平臺(tái)基礎(chǔ)。4、建立了檢測(cè)狐貍?cè)庠葱猿煞值腄NAzyme的方法。通過GeneBlast比對(duì),確定了狐貍12s核糖體亞基上特異性基因片段為靶標(biāo)片段。針對(duì)上述基因片段,設(shè)計(jì)了3組分別含有與靶標(biāo)片段互補(bǔ)序列和2個(gè)富含G島結(jié)構(gòu)的識(shí)別探針對(duì)。通過正交試驗(yàn),對(duì)DNAzyme檢測(cè)體系進(jìn)行了優(yōu)化,確定了該檢測(cè)體系的最適條件。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,該方法目測(cè)結(jié)果與光譜測(cè)定結(jié)果一致,可實(shí)現(xiàn)裸眼可視化檢測(cè)。由于該方法不需要特殊儀器設(shè)備,操作簡便,易于實(shí)現(xiàn)推廣和現(xiàn)場檢測(cè),具有較高的開發(fā)價(jià)值。結(jié)論:本論文針對(duì)國家亟待解決的摻假肉食品安全問題,開展了鑒別鼠、貂、狐貍、貉子肉源性成分的實(shí)驗(yàn)研究。本論文成功地建立了一系列可以同時(shí)檢測(cè)牛羊肉中貂、狐貍、貉子肉源性成分的PCR和MPCR方法,實(shí)現(xiàn)了高通量快速檢測(cè);基于LAMP原理對(duì)LAMP引物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,建立了新型的LAMP方法,極大地降低了反應(yīng)的非特異性擴(kuò)增,并首次成功的建立了肉品中鼠源性成分的新型LAMP鑒別方法,該方法快速、高效、靈敏度高,適用于現(xiàn)場檢測(cè)需求。首次將滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)技術(shù)和DNAzyme裸眼可視化顯色體系應(yīng)用在肉源性成分鑒別領(lǐng)域中,為肉源性成分快速鑒別提供了可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R440;R155.5
【部分圖文】：

EIEC、EHEC)的多重 PCR 方法[3]；何海寧等人利用多重 PCR重 PCR 方法，實(shí)現(xiàn)了同一 PCR 體系同時(shí)擴(kuò)增牛源性（116bp））和鴨源性（322bp）目的基因片段。Izadpanah[5]等人開發(fā)一種測(cè)肉和肉制品中豬、駱駝、綿羊、驢、山羊、牛和雞源性成分步應(yīng)用于動(dòng)物飼料的鑒定。Alikord[6]等人采用多重 PCR 擴(kuò)增對(duì)生肉和加工肉制品中的馬、驢、豬等反芻動(dòng)物進(jìn)行了鑒定。肌鈣蛋白 I（TnI）、線粒體核糖體蛋白（MRP）和肌鈣蛋白列設(shè)計(jì)引物，以區(qū)分雞、豬、山羊、牛肉和鴕鳥，單重 PCR 和檢測(cè)限分別為 0.01 和 20ng。并提供了使用基于 mRNA 的肉類法。Song[8-9]等人應(yīng)用了 TAQ DNA 聚合酶緩沖液中的拭子提本，替代了 DNA 提取過程，成功地縮短了 PCR 方法的時(shí)間。，多重 PCR 技術(shù)已經(jīng)非常成熟，可實(shí)現(xiàn) 2-7 重的多目標(biāo)基因片速、高通量檢測(cè)的首選檢測(cè)技術(shù)之一。

圖 2 多重 PCR 目的片段指數(shù)擴(kuò)增 環(huán)介導(dǎo)的等溫信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplifi）是 2000 年由日本研究人員 Notomi 博士發(fā)明的一種新型的體外等核酸片段的技術(shù)[10]。LAMP 技術(shù)的核心是針對(duì)靶基因 6 個(gè)區(qū)域的段設(shè)計(jì)引物和具有鏈置換活性的 BstDNA 聚合酶的應(yīng)用。BstDNA反應(yīng)溫度是 60-65℃，此恒溫條件下利用可以產(chǎn)生環(huán)狀結(jié)構(gòu)的A 聚合酶鏈置換合成的活性，在靶序列兩端引物結(jié)合處循環(huán)不斷地結(jié)構(gòu)，使得引物在等溫條件下引發(fā)新鏈合成，從而使靶基因高效擴(kuò)前，LAMP 技術(shù)已經(jīng)成功地應(yīng)用于臨床病原因子的檢測(cè)、遺傳因子質(zhì)量安全等多個(gè)領(lǐng)域。Ihira 等[12]利用瓊脂糖電泳法檢測(cè) LAMP 擴(kuò)接檢測(cè)患者血清中的 HHV-6 DNA。Poon 等[13]利用 LAMP 技術(shù)檢毒，以看家基因或外源性 RNA 分子作為陽性參照，檢測(cè)了 H1-H3

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文開發(fā)出基于 LAMP 原理的檢測(cè)肉源性成分的方法，并取得了很好的應(yīng)用效果。Amir Abdulmawjood[19]等人基于線粒體細(xì)胞色素b基因建立了LAMP檢測(cè)方法檢測(cè)鴕鳥肉成分。該方法是結(jié)合了實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，可以從肉制品中檢測(cè)出可達(dá) 0.01％的鴕鳥肉，檢測(cè)時(shí)間可在 15 min～20 min 內(nèi)完成，該 LAMP 方法同時(shí)具備良好的特異性和敏感性。楊麗霞[20]等針對(duì)豬肉線粒體 DNA COXⅠ基因設(shè)計(jì) LMAP引物，通過擴(kuò)增產(chǎn)物電泳和重點(diǎn)染色法鑒定反應(yīng)，并采用熒光檢測(cè)儀實(shí)施監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)果表明該LAMP方法能有效和特異性地檢測(cè)出牛羊肉中的豬肉成分。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 姚棟;張如勝;歐新華;;多重PCR快速檢測(cè)3種致瀉性大腸埃希菌方法的建立[J];國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2015年08期

2 黃偉;楊秀娟;張燕鳴;黃宇;陶琳麗;;近紅外光譜技術(shù)在肉類定性鑒別中的研究進(jìn)展[J];肉類研究;2014年01期

3 張?zhí)熳?;我國肉類食品產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[J];農(nóng)產(chǎn)品加工;2013年12期

4 楊麗霞;淑君;彭新凱;;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)牛羊肉中的豬肉成分[J];食品與機(jī)械;2013年05期

5 馮永巍;王琴;;肉類摻假檢驗(yàn)技術(shù)研究進(jìn)展[J];食品與機(jī)械;2013年04期

6 凌睿;薛建麗;楊軍;張馳;程逸宇;高翔;邱皓璞;;Real-Time PCR溶解曲線及Myostatin基因在肉類摻假快速鑒別中的應(yīng)用[J];食品科技;2013年05期

7 逯文娟;本刊編輯部;;從羊肉造假看食品安全監(jiān)管[J];食品安全導(dǎo)刊;2013年05期

8 李通;尹艷;王海;姜艷彬;侯東軍;袁其朋;于雷;;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)快速鑒別5種常見肉類別[J];食品科學(xué);2013年08期

9 楊麗霞;宋濤平;謝曉紅;付冠艷;劉佩;彭新凱;;SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)PCR技術(shù)鑒定鴨源性成分的研究[J];中國農(nóng)學(xué)通報(bào);2013年11期

10 尚柯;段慶梓;張玉;張良;;多重PCR法用于畜肉源性鑒定的研究[J];食品工業(yè)科技;2013年08期

本文編號(hào)：2820618