發(fā)布時(shí)間：2020-09-14 16:48

　　 微小核糖核酸(miRNA)作為一類重要的內(nèi)源性調(diào)控型核酸分子和疾病標(biāo)志物,實(shí)現(xiàn)其靈敏而特異的分析對(duì)于生命活動(dòng)機(jī)理的闡釋以及臨床疾病的診斷和治療等都具有非常重要的意義。而傳統(tǒng)的基于有機(jī)熒光染料分子標(biāo)記探針作為信號(hào)輸出的miRNA檢測方法大都面臨光穩(wěn)定性差、壽命短、易漂白、生物毒性大等問題。近年來,隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展,一系列新型熒光納米探針不斷涌現(xiàn)并展示出光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、熒光強(qiáng)度高、尺寸可調(diào)、易于修飾和功能化改性等諸多優(yōu)點(diǎn)。其中,DNA穩(wěn)定的熒光金屬納米簇,因兼有生物水溶性好、生物毒性低、操作簡單、設(shè)計(jì)靈活等優(yōu)勢,目前已作為一種極具應(yīng)用前景的新型免標(biāo)記熒光探針,在生化分析領(lǐng)域吸引了極大的關(guān)注和研究熱情。尤其是以核酸為合成模板的特點(diǎn),使得DNA穩(wěn)定熒光金屬納米簇與核酸放大技術(shù)的結(jié)合非常便利,從而為開發(fā)miRNA這類在實(shí)際體系中表達(dá)豐度極低的靶物質(zhì)分析方法提供了新契機(jī)�；诖�,本論文即以發(fā)展高選擇性和高靈敏度的新型miRNA檢測方法為目標(biāo),分別選擇末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的“超長”poly T穩(wěn)定熒光銅納米顆粒和以富含胞嘧啶DNA單鏈為模板介導(dǎo)合成的高強(qiáng)度熒光銀納米簇為信號(hào)輸出源,通過分別結(jié)合氧化石墨烯-DNase Ⅰ靶循環(huán)放大策略和催化發(fā)夾自組裝放大機(jī)制,系統(tǒng)開展了基于DNA穩(wěn)定熒光金屬納米簇結(jié)合靶循環(huán)放大策略的miRNA分析研究。具體包括以下研究內(nèi)容:1.基于“超長”poly T穩(wěn)定熒光銅納米顆粒結(jié)合石墨烯-DNase Ⅰ靶循環(huán)放大機(jī)制的miRNA免標(biāo)記檢測通過巧妙結(jié)合具有單雙鏈核酸可控吸附性能和酶切保護(hù)作用的氧化石墨烯(GO)、能選擇性剪切DNA的脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)以及末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的“超長”polyT穩(wěn)定熒光銅納米顆粒(superlongpolyT-CuNPs)分析平臺(tái),成功發(fā)展了一種簡單、精準(zhǔn)、高選擇性的miRNA免標(biāo)記、放大檢測新方法。在該方法中,GO可將與靶miRNA完全互補(bǔ)的DNA捕獲探針吸附于表面,在靶標(biāo)存在時(shí),miRNA和DNA通過堿基配對(duì)形成雙鏈。由于GO對(duì)雙鏈核酸吸附能力較弱,miRNA-DNA雙鏈可以從GO表面解脫下來進(jìn)入溶液中。加入DNase Ⅰ后,DNase Ⅰ可選擇性將該雙鏈中的DNA剪切成多條片段,進(jìn)而使miRNA重新釋放并進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)中。反應(yīng)結(jié)束后,通過離心去除GO并提取上清液,加入TdT和dTTP溶液進(jìn)行poly T聚合。所獲得的超長poly T產(chǎn)物即可作為模板,在Cu2+和抗壞血酸的作用下合成熒光銅納米顆粒,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)miRNA的檢測。選擇let-7a作為模式靶標(biāo),熒光分析和電泳表征都證實(shí)該方法具有很好的循環(huán)放大分析可行性,并在50 pM-10nM范圍內(nèi)顯示出良好的線性相關(guān)性,實(shí)際檢測限達(dá)到50 pM。同時(shí),選擇五組對(duì)照miRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),該方法對(duì)于let-7a的分析具有較好的選擇性,并可成功用于血清樣品中靶miRNA的檢測,為發(fā)展新型免標(biāo)記miRNA檢測方法提供了新思路。2.基于DNA穩(wěn)定銀納米簇激活式熒光探針結(jié)合催化發(fā)夾自組裝技術(shù)的miRNA循環(huán)放大檢測研究利用本課題組發(fā)現(xiàn)的具有高強(qiáng)度熒光輸出的DNA穩(wěn)定銀納米簇(DNA-AgNCs)作為信號(hào)源,通過引入標(biāo)有淬滅基團(tuán)BHQ1的DNA封閉探針,成功構(gòu)建了一種激活式熒光探針,其熒光淬滅效率和激活效率分別高達(dá)90%和92%。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步結(jié)合催化發(fā)夾自組裝(CHA)放大技術(shù),巧妙地將靶標(biāo)設(shè)計(jì)為CHA反應(yīng)的觸發(fā)鏈,發(fā)展了一種miRNA循環(huán)放大檢測新方法。在該方法中,具體設(shè)計(jì)了 H1和H2兩個(gè)發(fā)夾探針,H1將可激活DNA-AgNCs激活式熒光探針的DNA序列封閉于莖部結(jié)構(gòu)中,H2則負(fù)責(zé)實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)的循環(huán)利用。在靶標(biāo)不存在時(shí),H1、H2由于本身二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,不能相互雜交,CHA反應(yīng)不會(huì)進(jìn)行,從而沒有信號(hào)激活發(fā)生;在靶標(biāo)存在時(shí),miRNA通過堿基配對(duì)打開H1,進(jìn)而H1暴露的另一端又將H2打開并形成H1-H2雜交雙鏈,與此同時(shí),靶標(biāo)被釋放并進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)。由于CHA反應(yīng)產(chǎn)物H1-H2雜交雙鏈可有效激活DNA-AgNCs激活式熒光探針,該熒光信號(hào)的輸出即可指示靶標(biāo)的存在和含量。于是,在對(duì)CHA體系序列、緩沖液體系以及激活式熒光探針的序列和比例等條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化后,選擇miRNA-21作為模式靶標(biāo),通過熒光分析和電泳實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該方法可成功實(shí)現(xiàn)對(duì)靶miRNA的高選擇性循環(huán)放大檢測。該方法具有操作簡單、免酶、免洗等優(yōu)點(diǎn),尤其通過DNA穩(wěn)定銀納米簇的引入,有望為miRNA的高選擇性和高靈敏度分析提供一個(gè)新的平臺(tái)。
【學(xué)位單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R440;O657.3
【部分圖文】：

以ＤＮＡ為模板成功介導(dǎo)合成ＡｕＮＣｓ的報(bào)道相對(duì)較少。Ｚｈｏｕ１４８］等報(bào)道了在超聲作逡逑用下利用雙鏈ＤＮＡ和刻蝕成單原子分散的金納米晶體合成具有熒光的八１：８的方逡逑法；以�。保保薄辏ǎ蓿郏矗梗莸龋▓D１．１）證明了以檸檬酸鹽為還原劑，？0１丫（：和？０以八分別在逡逑ｐＨ＝３，邋Ｃ３0：Ａｕ＝ｌ：２和ｐＨ＝６－７，Ａ３0：Ａｕ＝ｌ：３０的條件下均可以很好的合成藍(lán)色的勞逡逑光ＡｕＮＣｓ；邋ＩＶ５０］等以２３個(gè)堿基的特定ＤＮＡ序歹ＩＪ作為模板，二甲胺硼烷為還原逡逑劑合成了紅色ＡｕＮＣｓ。在進(jìn)一步研宄后發(fā)現(xiàn)多種發(fā)夾ＤＮＡ分子也可以作為合成逡逑４逡逑

ＤＮＡ穩(wěn)定熒光銅納米顆粒的合成模板有兩種，一種是雙鏈ＤＮＡ邋（ｄｓＤＮＡ），逡逑一種是單鏈ＤＮＡ邋（ｓｓＤＮＡ），但還原劑均為抗壞血酸。ｄｓＤＮＡ隨機(jī)序列可以作為逡逑介導(dǎo)合成ＣｕＮＰｓ的模板是由？＾0處丨１＂［５８］等（圖１．４）邋２０１０年首次發(fā)現(xiàn)的，并且證逡逑明了合成的ＣｕＮＰｓ的熒光強(qiáng)度隨著模板雙鏈ＤＮＡ長度的增加而增強(qiáng)，但單鏈及逡逑三重ＤＮＡ和雙鏈肽核酸則不具備該功能。自此以后，打開了利用ＤＮＡ為模板介逡逑導(dǎo)合成熒光銅納米顆粒研究的大門。逡逑Ｃｕ°逡逑Ｉ．．．．．．ｉｉ．．．．．．ｉ．ｉ．邋ｉ．Ｉ．．．．．．．Ｃｕ２＊邋ｎＴＴＴＴＴＴｌ逡逑ＬＬＬＵ邋ａｓｃｏｒ＾ｔｅ邋ＬＪＪＪＪ逡逑Ｃｕ°逡逑Ｉ邋ｌ邋ｌ邋ｌ邋ｌｌ邋１邋ｌ邋ｌ邋Ｉ邋ｉ邋ｌ邋ｌ邋Ｃｕ２、Ｉ邋ｌ邋Ｊ邋uk邋ｉ邋■邋ｉ邋ｌ邋■邋｜邋｜邋｜邋｜逡逑Ｉ邋１邋１邋１邐？，．Ｊ邋ａｓｃｏｒｂａｔｅ邋ＬＪ．－ＬＬ．ＬｌＩ．邋■丨逡逑Ｃ．．２＋逡逑ｉ邋ｔ邋Ｍ邋Ｉ邋ｉ邋ｔ邋Ｉ邋ｔ邐￣￣＾邐ｎｏ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ逡逑ａｓｃｏｒｂａｔｅ逡逑圖１．４以雙鏈ＤＮＡ隨機(jī)序列為模板合成熒光銅納米顆粒［５８］逡逑后來，本課題組的Ｑｉｎｇ［５９，６（）］等（圖１．５、圖１．６）對(duì)此也進(jìn)行了深入研宄，發(fā)逡逑現(xiàn)特殊序列的ｐｏｌｙ邋Ｔ單鏈及ｐｏｌｙＡＴ／ＴＡ雙鏈也可以作為合成熒光ＣｕＮＰｓ的模板，逡逑并且發(fā)現(xiàn)了合成的焚光ＣｕＮＰｓ的突光強(qiáng)度與ｐｏｌｙ邋Ｔ及ｐｏｌｙ邋ＡＴ／ＴＡ的長度成正比。逡逑這一發(fā)現(xiàn)極大豐富了合成ＣｕＮＰｓ的ＤＮＡ模板種類，并使得ＣｕＮＰｓ的應(yīng)用前景更逡逑加廣闊。逡逑－ｎ－Ｔ－ｒ－ｒ邐以。卿氣逡逑Ｃｕ２＊邐Ｌ

ＤＮＡ穩(wěn)定熒光銅納米顆粒的合成模板有兩種，一種是雙鏈ＤＮＡ邋（ｄｓＤＮＡ），逡逑一種是單鏈ＤＮＡ邋（ｓｓＤＮＡ），但還原劑均為抗壞血酸。ｄｓＤＮＡ隨機(jī)序列可以作為逡逑介導(dǎo)合成ＣｕＮＰｓ的模板是由？＾0處丨１＂［５８］等（圖１．４）邋２０１０年首次發(fā)現(xiàn)的，并且證逡逑明了合成的ＣｕＮＰｓ的熒光強(qiáng)度隨著模板雙鏈ＤＮＡ長度的增加而增強(qiáng)，但單鏈及逡逑三重ＤＮＡ和雙鏈肽核酸則不具備該功能。自此以后，打開了利用ＤＮＡ為模板介逡逑導(dǎo)合成熒光銅納米顆粒研究的大門。逡逑Ｃｕ°逡逑Ｉ．．．．．．ｉｉ．．．．．．ｉ．ｉ．邋ｉ．Ｉ．．．．．．．Ｃｕ２＊邋ｎＴＴＴＴＴＴｌ逡逑ＬＬＬＵ邋ａｓｃｏｒ＾ｔｅ邋ＬＪＪＪＪ逡逑Ｃｕ°逡逑Ｉ邋ｌ邋ｌ邋ｌ邋ｌｌ邋１邋ｌ邋ｌ邋Ｉ邋ｉ邋ｌ邋ｌ邋Ｃｕ２、Ｉ邋ｌ邋Ｊ邋uk邋ｉ邋■邋ｉ邋ｌ邋■邋｜邋｜邋｜邋｜逡逑Ｉ邋１邋１邋１邐？，．Ｊ邋ａｓｃｏｒｂａｔｅ邋ＬＪ．－ＬＬ．ＬｌＩ．邋■丨逡逑Ｃ．．２＋逡逑ｉ邋ｔ邋Ｍ邋Ｉ邋ｉ邋ｔ邋Ｉ邋ｔ邐￣￣＾邐ｎｏ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ逡逑ａｓｃｏｒｂａｔｅ逡逑圖１．４以雙鏈ＤＮＡ隨機(jī)序列為模板合成熒光銅納米顆粒［５８］逡逑后來，本課題組的Ｑｉｎｇ［５９，６（）］等（圖１．５、圖１．６）對(duì)此也進(jìn)行了深入研宄，發(fā)逡逑現(xiàn)特殊序列的ｐｏｌｙ邋Ｔ單鏈及ｐｏｌｙＡＴ／ＴＡ雙鏈也可以作為合成熒光ＣｕＮＰｓ的模板，逡逑并且發(fā)現(xiàn)了合成的焚光ＣｕＮＰｓ的突光強(qiáng)度與ｐｏｌｙ邋Ｔ及ｐｏｌｙ邋ＡＴ／ＴＡ的長度成正比。逡逑這一發(fā)現(xiàn)極大豐富了合成ＣｕＮＰｓ的ＤＮＡ模板種類，并使得ＣｕＮＰｓ的應(yīng)用前景更逡逑加廣闊。逡逑－ｎ－Ｔ－ｒ－ｒ邐以。卿氣逡逑Ｃｕ２＊邐Ｌ

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本文編號(hào)：2818409