背景膿毒癥是一種由各種致病微生物和內(nèi)毒素釋放引起的全身炎癥反應(yīng)綜合癥(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),也是病人在受到急惡性創(chuàng)傷和休克后常出現(xiàn)的并發(fā)癥。高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)主要是體內(nèi)的免疫細胞如單核細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞在受到內(nèi)毒素和炎癥因子的刺激后產(chǎn)生和分泌的,在膿毒癥發(fā)生和發(fā)展中扮演重要作用,在膿毒癥中HMGB1是一個重要的免疫調(diào)控因子。HMGB1與其他的免疫調(diào)節(jié)因子相互作用,調(diào)控機體的免疫反應(yīng),誘導(dǎo)和增強機體的免疫反應(yīng)。研究表明HMGB1能夠促進巨噬細胞的遷移,以及各種炎癥因子的釋放,這些炎癥因子能夠促進各種免疫細胞的聚集,進而誘導(dǎo)膿毒癥的免疫反應(yīng)。已有研究證實,HMGB1表達的上調(diào)與膿毒癥的發(fā)生密切相關(guān)。微小RNA(microRNA)在真核生物中是高度保守的內(nèi)源非編碼小RNA,能夠通過與mRNA的3'-UTR(3'-untranslated region)完全和不完全互補的方式來調(diào)控靶基因的表達,調(diào)控免疫細胞的激活、炎癥因子的釋放以及免疫反應(yīng)的發(fā)生。越來越多的研究表明microRNA參與到膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展,臨床上可以將microRNA作為膿毒癥診斷的分子標志物。同時,膿毒癥病人外周血中的miR-25的表達也發(fā)生異常,這說明miR-25的異常可能與膿毒癥的病理過程有關(guān)。生物信息學(xué)研究分析表明HMGB1的3'-UTR存在一個miR-25靶向結(jié)合的位點。然而,miR-25是否能調(diào)控HMGB1的表達以及miR-25和HMGB1的表達異常對膿毒癥的生物學(xué)影響,這些都尚不清楚。目的分析膿毒癥病人體內(nèi)miR-25和HMGB1的表達,闡述miR-25、HMGB1和膿毒癥三者之間的關(guān)系,探究miR-25在調(diào)控HMGB1的表達和巨噬細胞炎癥因子的釋放中的作用,為臨床上尋找診斷和治療膿毒癥尋找新的靶點,為評估患者預(yù)后提供新的分子標志物。方法在本研究中,我們首先利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)巨噬細胞膿血癥和對照組做miRNA芯片,對結(jié)果進行聚類分析,找出差異表達的miRNA,預(yù)測目標miRNA-25。其次,我們利用LPS誘導(dǎo)巨噬細胞,檢測巨噬細胞中miRNA-25、早期炎癥因子TNF-α和IL-6、晚期炎癥因子HMGB1的表達差異,利用小鼠模型分析了miR-25、HMGB1和膿毒癥三者之間的關(guān)系以及對小鼠存活率的影響。最后,我們通過分析膿毒癥病人體內(nèi)miR-25和HMGB1的表達,探究miR-25在調(diào)控HMGB1的表達和巨噬細胞炎癥因子的釋放中的作用。結(jié)果(1)miR-25抑制膿毒癥巨噬細胞炎癥因子的分泌的機制研究,我們發(fā)現(xiàn):首先miR-25能夠靶向抑制HMGB1的表達。microRNA.org在線靶向基因預(yù)測結(jié)果表明,HMGB1 mRNA的3'-UTR存在一個miR-25靶向結(jié)合的位點。miR-25 mimic的表達能夠顯著降低相關(guān)luciferase活性,這說明miR-25能夠靶向結(jié)合HMGB1的3'-UTR,從而抑制HMGB1的表達。其次,LPS能夠誘導(dǎo)巨噬細胞分泌HMGB1,且抑制miR-25的表達。流式結(jié)果表明巨噬細胞經(jīng)M-CSF誘導(dǎo)7天以后,巨噬細胞特定的蛋白分子標志物CD68的表達提高了80%,這說明巨噬細胞的分化成功被誘導(dǎo),可進行后續(xù)實驗。Elisa試驗表明,細胞經(jīng)過100ng/mL LPS處理48h之后,細胞上清中炎癥因子HMGB1、TNF-α和IL-6的表達顯著提高。qRT-PCR的結(jié)果表明,LPS的處理巨噬細胞能夠顯著上調(diào)HMGB1 mRNA的表達,顯著下調(diào)miR-25的表達。Western blot結(jié)果表明,LPS處理能夠顯著增強NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,也能上調(diào)巨噬細胞HMGB1的表達。最后,miR-25能夠抑制巨噬細胞HMGB1的表達和細胞遷移。細胞在轉(zhuǎn)入miR-25 mimic或者si-HMGB1后,巨噬細胞HMGB1的mRNA和蛋白水平顯著降低,同時也導(dǎo)致p-p65的水平也顯著降低。此外,細胞上清液中HMGB1、TNF-α和IL-6的水平也發(fā)生顯著下調(diào),巨噬細胞的遷移能力也明顯受到抑制。這說明miRNA-25能夠通過抑制HMGB1的表達而抑制膿毒癥誘導(dǎo)的細胞炎癥因子的表達。(2)利用小鼠模型證明miR-25 mimics能夠通過調(diào)控HMGB1抑制膿毒癥的進展,對照組每次注射等體積的生理鹽水,LPS組在連續(xù)三天注射生理鹽水之后,第四天注射濃度為1mg/ml的LPS(劑量為10mg/kg),LPS+miRNA-25 mimics組尾靜脈注射miRNA-25 mimics(miR-25激動劑,30mg/kg/day),連續(xù)注射三天后,第四天尾靜脈注射LPS,檢測小鼠不同組織和血清中miRNA-25、HMGB1的表達情況,測量小鼠血清中細胞因子TNF-α、IL-6的水平,統(tǒng)計不同組膿毒癥小鼠的死亡情況。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn):qRT-PCR檢測不同組小鼠miRNA-25在血清和肺、肝臟、脾、心臟和腎臟等不同器官組織中的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),LPS組小鼠血清和不同組織的miRNA-25的表達明顯低于對照組,兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05).而小鼠在注射miRNA-25 mimics之后,miRNA-25的表達上升,恢復(fù)至正常水平,與對照組差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。qRT-PCR檢測不同組小鼠HMGB1在血清和肺、肝臟、脾、心臟和腎臟等不同器官組織中的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),LPS組小鼠血清和不同組織的miRNA-25的表達明顯高于對照組,兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05).而小鼠在注射miRNA-25 mimics之后,HMGB1的表達下降,恢復(fù)至正常水平,與對照組差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。ELISA檢測不同組小鼠血清中細胞因子TNF-α、IL-6的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),LPS組小鼠血清中細胞因子TNF-α、IL-6的表達明顯高于對照組,兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05).而小鼠在注射miRNA-25 mimics之后,血清中細胞因子TNF-α、IL-6的表達下降,恢復(fù)至正常水平,與對照組差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。在給小鼠尾靜脈注射生理鹽水和miR-25 mimics48h之后,利用尾靜脈注射LPS誘導(dǎo)小鼠膿毒癥,并觀察小鼠的生存率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,小鼠在注射miR-25mimics之后小鼠的10天生存率明顯提高(55.88%vs20.00%),miR-25過表達對膿毒癥小鼠病死率的改善主要是從LPS誘導(dǎo)后4天逐漸明顯。這說明在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型中,miRNA-25能夠抑制小鼠HMGB1的表達,進而抑制膿毒癥誘導(dǎo)的細胞炎癥因子TNF-α、IL-6的表達。(3)對膿毒癥患者進行血清中HMGB1和miRNA-25的檢測時,我們發(fā)現(xiàn):與健康對照組相比,膿毒癥患者外周血血清中的HMGB1的含量明顯高于對照組,兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。Western blot結(jié)果表明與健康對照組相比,膿毒癥患者外周血單核細胞(peripheral blood monouclear cells,PBMC)中HMGB1的表達明顯高于對照組,兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。qRT-PCR結(jié)果表明與健康對照組相比,膿毒癥患者外周血血清和PBMC中的miR-25的表達均顯著低于對照組,兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。皮爾遜相關(guān)分析表明膿毒癥患者血清中miR-25的表達與HMGB1的含量呈負相關(guān)(r=-0.591,P=0.041)。對于膿毒癥患者來說,血清中HMGB1的含量與PBMC中HMGB1的表達呈正相關(guān)(r=0.537,P0.001),血清中miR-25的表達與HMGB1的含量呈負相關(guān)(r=-0.622,P0.001)。結(jié)論LPS處理巨噬細胞組、LPS小鼠組、膿毒癥患者組miR-25的下調(diào)和HMGB1的上調(diào)與膿毒癥的發(fā)生有關(guān)。miR-25通過轉(zhuǎn)染膿毒癥小鼠能夠減弱LPS誘導(dǎo)的HMGB1的表達,抑制NF-κB和下游炎癥因子TNF-α和IL-6。因此,臨床上可能將miR-25作為診斷膿毒癥進程的分子標志物。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R459.7
【部分圖文】：

安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文背景干凈，信號單一，RNA 芯片在雜交洗脫的過程中不存在污染。對 m片的數(shù)據(jù)做聚類 hot map 分析，橫坐標為樣本，縱坐標為差異表達的 mi果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，LPS 誘導(dǎo)的巨噬細胞組有 12 個 miRNA 的表達存其中有 5 個發(fā)生上調(diào)，有 7 個發(fā)生下調(diào)（如圖 2.1.3）。

2芯片掃描雜交圖像

圖 2.1.3 miRNA 芯片的數(shù)據(jù)做聚類 hot map 分析選擇了 2 個 miRNA microarrays 分析存在差異表達的一步的驗證，我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比，LPS 處理表達上調(diào)（p＜0.05），miRNA-25 的表達下調(diào)（p＜0.05）（arrays 和 qPCR 結(jié)果表明巨噬細胞在經(jīng)過 LPS 處理以后。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 郭健;胡冠宇;錢義明;錢風華;沈夢雯;趙雷;;從miRNA-146a調(diào)控TLR-4/NF-κB通路探討升降散保護大鼠膿毒癥心肌機制的研究[J];中國急救醫(yī)學(xué);2018年05期

2 陳洪衛(wèi);梁冬雨;婁曉麗;侯彥強;;膿毒癥血清miRNA表達譜的初步研究[J];中華生物醫(yī)學(xué)工程雜志;2016年02期

3 童森;祝筱梅;吳瑤;于燕;李志清;姚詠明;;拮抗高遷移率族蛋白B1對燙傷小鼠白細胞介素-35表達及T淋巴細胞免疫功能的影響[J];中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志;2016年01期

4 王勝云;陳德昌;;降鈣素原和C-反應(yīng)蛋白與膿毒癥患者病情嚴重程度評分的相關(guān)性研究及其對預(yù)后的評估價值[J];中國危重病急救醫(yī)學(xué);2015年02期

5 李金鳳;黃立鋒;姚詠明;張淑文;李文雄;張震宇;王淑珍;;黃芪甲苷在體外對高遷移率族蛋白B1介導(dǎo)小鼠調(diào)節(jié)性T淋巴細胞免疫功能的影響[J];北京中醫(yī)藥;2014年11期

6 張澤信;王曉霞;楊灣灣;張二飛;侯立朝;;膿毒癥分子機制及miRNA在膿毒癥中的作用[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展;2014年22期

7 趙永禎;李春盛;;生物標志物組合對急診膿毒癥和重度膿毒癥患者的診斷價值[J];中華危重病急救醫(yī)學(xué);2014年03期

8 陳煒;趙磊;牛素平;王鎖柱;盛博;甄潔;古旭云;呂超;;不同炎癥因子對細菌性血流感染所致膿毒癥患者的早期診斷價值[J];中華危重病急救醫(yī)學(xué);2014年03期

9 茅堯生;李智鑫;呂鐵;周蕾;;高通量連續(xù)性血液濾過治療對創(chuàng)傷膿毒癥患者外周血單核細胞miRNA-146表達的影響[J];中華創(chuàng)傷雜志;2013年12期

10 張烈;嚴一核;謝渭根;;連續(xù)性血液濾過治療對嚴重膿毒癥患者炎癥介質(zhì)及單核細胞中TLR4和miRNA-146a的影響[J];中國急救醫(yī)學(xué);2013年11期

本文編號：2818030