背景與目的1989年在德國首次發(fā)現(xiàn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended spectrum beta-lactamases ESBL)。近年來,在第三、四代頭孢菌素以及新型廣譜β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的廣泛應用所造成的抗性選擇壓力下,CTX-M型ESBL在臨床的檢出率日趨增高,已替代SHV型和TEM型,成為醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染中最常見的ESBL型別。CTX-M型ESBL在全球范圍呈現(xiàn)快速傳播趨勢,目前在大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等至少26種細菌的菌株中均檢出有CTX-M型ESBL。CTX-M-65基因?qū)儆贑TX-M-9組,和CTX-M-14相較,有兩個位點的突變,即丙氨酸(GCC)80?纈氨酸(GTC)和絲氨酸(AGC)275?精氨酸(CGC)。自2007年于中國某醫(yī)院一弗氏檸檬酸桿菌分離株中首次發(fā)現(xiàn)CTX-M-65型ESBL后,十年間,bla_(CTX-M-65)已在中國、韓國、美國等多個國家快速流行傳播,宿主菌涉及大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和沙門氏菌等多種菌屬,感染宿主涵蓋人、家禽、野生動植物、水源等,存在于人類和動物日常生活的各個領域,嚴重威脅公共衛(wèi)生安全,妨礙畜牧業(yè)的發(fā)展。因此,對CTX-M-65基因分布、傳播機制及基因環(huán)境的研究,可以明確其基因定位,從而有效控制其轉(zhuǎn)移,遏制其擴散和傳播,臨床意義與社會價值顯著。Bla_(CTX-M)基因超過大半定位于質(zhì)粒上,少部分存在于染色體上。耐藥基因的定位和菌株的型別具有一定聯(lián)系。Bla_(CTX-M)基因定位于質(zhì)粒上遺傳穩(wěn)定性較差,反之,存在于染色體上時,具有良好的遺傳穩(wěn)定性。Bla_(CTX-M)基因通過質(zhì)粒進行水平傳播,接合性質(zhì)�？梢越閷湓谕N或不同種屬細菌之間轉(zhuǎn)移、傳播,促使耐藥菌株劇增,嚴重時導致泛耐藥菌株的爆發(fā)和流行。Bla _(CTX-M)基因周圍的可移動遺傳序列,如bla_(CTX-M)上游的插入序列ISEcpI、IS26和下游的插入序列IS903、ORF477等,對其表達和轉(zhuǎn)移等產(chǎn)生非常關鍵的調(diào)控作用,上述可移動元件單獨或同時參與耐藥基因的表達與調(diào)控。本課題組的前期研究中,在河南地區(qū)首次從肺炎克雷伯菌中檢出bla_(CTX-M-65),但是本地其它菌種菌株中是否有bla_(CTX-M-65)的流行,bla_(CTX-M-65)上下游基因結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)移播散能力,以及流行菌株間是否具有關聯(lián)均不清楚。為解決上述問題,我們進行該課題研究,擬通過統(tǒng)計分析所收集的臨床標本,明確河南地區(qū)攜bla_(CTX-M-65)菌株的分布、流行情況;通過bla_(CTX-M-65)的基因定位以及高通量測序,探明其基因環(huán)境;通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合實驗,分析bla_(CTX-M-65)的播散機制;通過多位點序列分型技術,研究攜bla _(CTX-M-65)菌株的遺傳異質(zhì)性,目的是為臨床控制攜bla_(CTX-M-65)菌株所致感染提供科學的指導。方法1.菌株鑒定及藥敏分析收集2016年9月-2017年1月鄭州大學第一附屬醫(yī)院檢驗科細菌室分離的,來源于痰液(含肺泡灌洗液)、分泌物(含膿液)、血液、尿液、糞便以及各種引流液等標本,對第三代頭孢菌素耐藥的革蘭陰性桿菌。所有實驗菌株均用VITEKⅡCOMPACT微生物全自動鑒定分析儀鑒定到種。藥敏結(jié)果依據(jù)2016年CLSI標準判讀。2.ESBL初篩和確證試驗嚴格按照CLSI 2014年標準,進行可疑菌株ESBL初篩和確證實驗。3.Bla_(CTX-M-65)在細菌中的定位研究和基因環(huán)境分析PCR擴增bla_(CTX-M-9)組基因,并將擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,置于UVP凝膠成像分析儀下分析,初步篩選出bla_(CTX-M-65)基因陽性菌株。提取初篩陽性菌株的質(zhì)�；�,通過PCR擴增后,測序,明確bla_(CTX-M-65)基因在細菌中的定位,探明bla_(CTX-M-65)的基因環(huán)境。4.菌株的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合試驗通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合試驗,分析攜bla_(CTX-M-65)基因質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性。5.菌株的同源性分析通過多位點序列分型(MLST)技術,對攜bla_(CTX-M-65)基因的菌株進行遺傳異質(zhì)性分析。結(jié)果1.CTX-M-65型ESBL在革蘭陰性桿菌的分布測序結(jié)果顯示,在收集的369株耐三代頭孢菌素的革蘭陰性桿菌中,279株腸桿菌科細菌中12株攜bla_(CTX-M-65)基因,其中10株肺炎克雷伯菌、2株大腸埃希菌。在90株非發(fā)酵菌中未檢出bla_(CTX-M-65)基因。2.ESBL初篩和表型確證試驗12株攜bla_(CTX-M-65)菌株的ESBL確證試驗均表現(xiàn)為陰性。3.Bla_(CTX-M-65)的基因定位和基因環(huán)境分析所有菌株的bla_(CTX-M-65)基因定位于質(zhì)粒上。Bla_(CTX-M-65)基因上下游基因元件擴增測序結(jié)果顯示,其上游主要為插入序列ISEcp1和IS26,下游均為插入序列IS903。共檢出四種不同種類的基因組件。組件一:IS26-?ISEcp1-472bp-bla_(CTX-M-65)-?IS903;組件二,IS26-?ISEcp1-42bp-bla_(CTX-M-65)-?IS903;組件三,IS26-?ISEcp1-66bp-bla_(CTX-M-65)-?IS903;組件四,bla_(CTX-M-65)-?IS903。4.質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合試驗8個雙抗麥康凱平板上接合子均生長,供體菌、受體菌均不生長。通過提取接合子質(zhì)粒DNA,經(jīng)PCR擴增后測序結(jié)果進行局部序列比對法BLAST,bla_(CTX-M-65)基因標準序列相似度100%。5.MLST分型結(jié)果共獲得4種不同的ST型別。10株肺炎克雷伯菌的MLST分型結(jié)果為ST11和ST258,主要為ST11(8/10)。2株大腸埃希菌MLST分型結(jié)果為ST117和ST4360,分別來自呼吸科和新生兒科。結(jié)論1.河南地區(qū)CTX-M-65型ESBL在革蘭陰性桿菌中具有很高的流行率,且攜bla_(CTX-M-65)菌株均為多重耐藥菌株。2.所有分離菌株攜帶bla_(CTX-M-65)基因定位于質(zhì)粒上。Bla_(CTX-M-65)基因上游主要為插入序列ISEcp1和IS26,下游均為插入序列IS903。3.可接合性質(zhì)粒及bla_(CTX-M-65)周圍的插入序列ISEcp1、IS903等遺傳元件參與bla_(CTX-M-65)基因的廣泛播散和轉(zhuǎn)移。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R446.5
【部分圖文】：

ESBL表型確證試驗

blaCTX-M-65基因環(huán)境示意圖

陽性轉(zhuǎn)移接合子的瓊脂糖凝膠電泳

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 Khalid M Bindayna;Mariam Murtadha;;High prevalence of bla_(CTX-M) in Enterobactcriaceac isolates from the Kingdom of Bahrain[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2011年12期

相關碩士學位論文 前1條

1 胡曉欣;CTX-M-55型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶在革蘭陰性桿菌中的基因定位、基因環(huán)境與傳播機制研究[D];鄭州大學;2017年

本文編號：2815510