目的:卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一,由于其發(fā)病和進(jìn)展隱匿,早期多無明顯癥狀,就診時70%已屬晚期,病死率居于前列。鑒于卵巢癌的高發(fā)病率和致死率,以及在流行病學(xué)上脂聯(lián)素與癌癥的密切關(guān)系,本課題旨在探索脂聯(lián)素對卵巢癌細(xì)胞的增殖及凋亡有無影響以及可能的作用機(jī)制。方法:一、卵巢癌患者與健康志愿者脂聯(lián)素水平檢測1.卵巢癌患者與健康志愿者脂聯(lián)素水平檢測收集2013年1月至2013年12月間就診于中國醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的卵巢癌患者的血清標(biāo)本46份及腹水標(biāo)本25份,標(biāo)本滿足如下條件:(a)患者均為經(jīng)過病理學(xué)確診的卵巢癌患者,(b)以FIGO國際分期法分期明確的患者,(c)無高血壓、糖尿病等慢性病史。2.收集正常對照血清標(biāo)本17份,來源于2013年1月-2013年12月間于中國醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢的志愿者。志愿者滿足如下條件:體檢中未發(fā)現(xiàn)腫瘤及婦科疾病、無高血壓、糖尿病等慢性病史的健康女性。3.雙抗體夾心ELISA法檢測血清及腹水標(biāo)本的脂聯(lián)素水平。二、脂聯(lián)素對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響1.用Real-time PCR法及Western blotting法檢測卵巢癌SKOV3、Caov3細(xì)胞脂聯(lián)素受體1的表達(dá)水平。2.MTT比色法觀察卵巢癌SKOV3、Caov3細(xì)胞在不同濃度(0,5,10,50,100,200ng/ml)外源性脂聯(lián)素作用48小時后細(xì)胞的增殖情況。同法觀察以100ng/ml的外源性脂聯(lián)素刺激后不同時間點(diǎn)(24,48,72小時)細(xì)胞的增殖情況。3.采用Real-time PCR法及Western Blotting法觀察卵巢癌SKOV3、Caov3細(xì)胞在外源性脂聯(lián)素(100ng/ml)刺激48小時后細(xì)胞周期蛋白cyclin B的表達(dá)水平。4.采用Western Blotting法分析比較三個組(未處理組、H_2O_2(50μM)處理組以及H_2O_2(50μM)+脂聯(lián)素處理組)的Caov3細(xì)胞的凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bax的蛋白表達(dá)水平;同法比較SKOV3細(xì)胞三個亞組的凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bax的蛋白表達(dá)水平。三、脂聯(lián)素對分子Akt、ERK磷酸化的影響以100ng/ml的脂聯(lián)素刺激人卵巢癌細(xì)胞株Caov3和SKOV3細(xì)胞后,在不同時間(0分,10分,30分,60分)收集細(xì)胞,并采用Western Blotting法分析比較Caov3和SKOV3細(xì)胞的信號分子Akt、ERK的磷酸化。觀察脂聯(lián)素對抑制劑LY294002和PD98059處理后的卵巢癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響1、分別以Akt分子上游蛋白PI3K的抑制劑LY294002和ERK分子上游蛋白MEK的抑制劑PD98059處理人卵巢癌細(xì)胞株Caov3和SKOV3細(xì)胞1小時,再用100ng/ml脂聯(lián)素處理,采用MTT比色法觀察不同時間(24,48,72小時)細(xì)胞在脂聯(lián)素刺激后的增殖情況。2、采用Western Blotting法分析比較Caov3細(xì)胞5個組(未處理組、H_2O_2(50μM)處理組、H_2O_2(50μM)+100ng/ml脂聯(lián)素處理組、H_2O_2(50μM)+LY294002+100ng/ml脂聯(lián)素組、H_2O_2(50μM)+PD98059+100ng/ml脂聯(lián)素組)的細(xì)胞周期蛋白Cyclin B及凋亡相關(guān)蛋白caspase3、Bax的蛋白表達(dá)水平。同法分析比較SKOV3細(xì)胞5個組的細(xì)胞周期蛋白Cyclin B及凋亡相關(guān)蛋白caspase3、Bax的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1.FIGOⅠ-Ⅳ期的卵巢癌患者血清脂聯(lián)素濃度均顯著高于正常志愿者血清濃度(p0.05)。而FIGOⅣ期的卵巢癌患者血清脂聯(lián)素濃度顯著高于FIGOⅠ期的卵巢癌患者(p0.05),其他FIGO分期的卵巢癌患者血清脂聯(lián)素濃度間無顯著性差異(p0.05)2.FIGOⅢ-Ⅳ期的卵巢癌患者血清脂聯(lián)素濃度均低于腹水脂聯(lián)素濃度(p0.05)。3.Caov3和SKOV3細(xì)胞均有AdipoR1的mRNA和蛋白表達(dá),且在SKOV3細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)于Caov3細(xì)胞(p0.05)。4.以不同濃度的脂聯(lián)素刺激后,Caov3和SKOV3細(xì)胞的細(xì)胞存活率均有明顯的增加,且呈劑量依賴性。而以100ng/ml的脂聯(lián)素刺激后,在不同的時間點(diǎn)(24,48,72小時),脂聯(lián)素刺激組的細(xì)胞數(shù)量明顯增加。5.Caov3和SKOV3細(xì)胞在以100ng/ml的脂聯(lián)素刺激后,Cyclin B的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯上升(p0.01)6.以H_2O_2(50μM)處理Caov3和SKOV3細(xì)胞時,可以觀察到Caov3和SKOV3細(xì)胞的caspase 3、Bax的蛋白表達(dá)水平均有明顯上調(diào),而在脂聯(lián)素處理后,caspase3、Bax的蛋白表達(dá)水平下降。7.Caov3和SKOV3細(xì)胞在受脂聯(lián)素刺激后,p-Akt表達(dá)上升,Caov3細(xì)胞在第30分鐘,SKOV3細(xì)胞在第10分鐘p-Akt的表達(dá)最強(qiáng)。而p-ERK的表達(dá)也出現(xiàn)了上調(diào),Caov3細(xì)胞在第60分鐘,SKOV3細(xì)胞在第30分鐘p-ERK的表達(dá)最強(qiáng)。8.在外源性脂聯(lián)素(100ng/ml)刺激不同時間(24,48,72小時)后,Caov3和SKOV3細(xì)胞數(shù)量均有明顯的增加(p0.05)。LY294002+脂聯(lián)素處理組和PD98059+脂聯(lián)素處理組的細(xì)胞增殖在48和72小時顯著低于脂聯(lián)素刺激組(p0.05),在24小時沒有顯著性差異。同時還觀察到,H_2O_2(50μM)誘導(dǎo)Caov3和SKOV3細(xì)胞凋亡后,脂聯(lián)素刺激可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白Cyclin B的蛋白表達(dá)水平,而再以LY294002和PD98059處理后,脂聯(lián)素的上調(diào)作用受到了抑制。9.H_2O_2(50μM)誘導(dǎo)Caov3和SKOV3細(xì)胞凋亡后,細(xì)胞凋亡蛋白caspase3、Bax的蛋白表達(dá)水平上升,而脂聯(lián)素可以抑制細(xì)胞凋亡蛋白caspase3、Bax的蛋白表達(dá)水平的上升,而再以LY294002和PD98059處理后,脂聯(lián)素的抑制作用受到了拮抗。結(jié)論:1、卵巢癌患者血清脂聯(lián)素水平低于腹水中脂聯(lián)素水平,但是高于健康者的血清脂聯(lián)素水平。2、脂聯(lián)素可以促進(jìn)卵巢癌Caov3和SKOV3細(xì)胞的增殖。3、脂聯(lián)素可以激活卵巢癌細(xì)胞的PI3K-Akt、Raf-MEK-ERK途徑,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.31;R730.44
【部分圖文】：

Caov3、SKOV3細(xì)胞AdipoR1的mRNA轉(zhuǎn)錄及PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

ov3、SKOV3細(xì)胞AdipoR1的mRNA轉(zhuǎn)錄及PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電CR檢測Caov3、SKOV3細(xì)胞中的AdipoR1的mRNA轉(zhuǎn)錄，以AdipoRSKOV3細(xì)胞AdipoR1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異，* p <0.05。

圖3.3 MTT法觀察不同時間點(diǎn)卵巢癌細(xì)胞增殖。相比，在不同時間點(diǎn)（24、48、72小時），脂聯(lián)素刺激組的細(xì)胞數(shù)量均。脂聯(lián)素可以促進(jìn)Caov3、SKOV3細(xì)胞的增殖。表3.3 度脂聯(lián)素刺激卵巢癌細(xì)胞后MTT法測得的OD值（X±SD）。Caov3 細(xì)胞 SKOV3 細(xì)胞0.187±0.020 0.166±0.0100.261±0.022 0.231±0.0100.453±0.018 0.453±0.0260.589±0.026 0.642±0.033 0.777±0.034 0.710±0.034 0.916±0.040 0.956±0.026

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本文編號：2814505