發(fā)布時(shí)間：2020-09-03 19:42

　　 研究目的:手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是由多種腸道病毒引起的常見(jiàn)傳染病,我國(guó)手足口病暴發(fā)流行的主要病原體為腸道病毒71型(Enterovirus71,EV71)和柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A16,CA16),由于該病毒對(duì)人群健康危害較大,因此,早期快速、特異性地監(jiān)測(cè)EV71、CA16病原體并采取有針對(duì)性的預(yù)防控制措施,現(xiàn)已成為公共衛(wèi)生研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法存在操作復(fù)雜、耗時(shí)耗力、靈敏度低、特異性差等缺點(diǎn)。因此,建立一種快速、靈敏且特異性好的手足口病檢測(cè)方法十分必要。本課題旨在制備EV71、CA16型病毒卵黃抗體,并對(duì)其純度、蛋白含量、效價(jià)和特異性等指標(biāo)進(jìn)行效果評(píng)價(jià);通過(guò)靜電自組裝將卵黃抗體偶聯(lián)至金納米粒子表面以制備能夠特異性識(shí)別EV71、CA16的生物探針,基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技術(shù),建立一種手足口病的快速檢測(cè)方法,構(gòu)建EV71、CA16兩種手足口病病原體檢測(cè)試劑盒,在實(shí)際檢測(cè)工作中,僅需將經(jīng)預(yù)處理后的待檢樣本分別加入不同熒光淬滅體系中,即可實(shí)現(xiàn)一步檢測(cè),應(yīng)用于臨床樣本檢測(cè)中,并對(duì)該法的檢測(cè)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究方法:本課題成功制備了EV71型和CA16型病毒卵黃抗體,并對(duì)這兩種抗體的純度、蛋白含量、效價(jià)、特異性進(jìn)行鑒定;基于雞卵黃抗體和FRET技術(shù),建立手足口病的快速檢測(cè)方法并應(yīng)用于臨床樣本檢測(cè)中,對(duì)建立的檢測(cè)方法進(jìn)行效果評(píng)價(jià)。具體研究?jī)?nèi)容如下:1.采用滅活病毒作為抗原,免疫SPF級(jí)產(chǎn)蛋母雞,收集雞蛋,采用聚乙二醇沉淀法分離提取雞卵黃抗體;采用SDS-PAGE方法及蛋白濃度定量試劑盒(BCA)方法測(cè)定抗體純度及蛋白含量;采用間接ELISA(iELISA)方法檢測(cè)抗體效價(jià)和特異性;2.將上述制備的EV71、CA16雞卵黃抗體通過(guò)靜電自組裝與金納米粒子偶聯(lián),制備可以特異性識(shí)別EV71、CA16的金納米生物探針。通過(guò)傅里葉變換紅外光譜(FTIR)、紫外可見(jiàn)光譜(UV-Vis)、透射電子顯微鏡(TEM)、動(dòng)態(tài)光散射(DLS)和ZETA電位(Zeta potential)對(duì)金納米生物探針的組成、尺寸、形貌和性能進(jìn)行表征。3.基于雞卵黃抗體和FRET技術(shù)構(gòu)建手足口病臨床檢測(cè)體系。應(yīng)用上述制備的金納米生物探針和量子點(diǎn)構(gòu)建熒光淬滅體系,加入不同濃度的待檢病毒后,采用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)體系熒光值,建立熒光強(qiáng)度與病毒濃度的線性回歸方程,從而實(shí)現(xiàn)手足口病臨床樣本的定性、定量檢測(cè)。通過(guò)優(yōu)化檢測(cè)體系IgY-AuNPs用量、NaCl用量、熒光恢復(fù)時(shí)間等指標(biāo),對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度、特異性進(jìn)行評(píng)價(jià),構(gòu)建EV71、CA16兩種手足口病病原體檢測(cè)試劑盒,在實(shí)際檢測(cè)工作中,僅需將經(jīng)預(yù)處理后的待檢樣本分別加入不同熒光淬滅體系中,即可實(shí)現(xiàn)兩種病原體的定性、定量檢測(cè),滿足手足口病臨床樣本的快速篩查和檢測(cè)的實(shí)際需要。研究結(jié)果:1.本實(shí)驗(yàn)制備的EV71、CA16型病毒卵黃抗體純度較好,輕重鏈分明,條帶清晰,無(wú)其他明顯雜帶;EV-71-IgY平均蛋白含量為26.60 mg·L~(-1),抗體最高效價(jià)為1:512000;CA-16-IgY平均蛋白含量為12.15 mg·L~(-1);抗體最高效價(jià)為1:128000;兩種雞卵黃抗體特異性均良好,能特異性識(shí)別靶病毒而不與干擾物結(jié)合。2.基于EV-71-IgY和FRET原理,建立EV71型手足口病病原體檢測(cè)方法。經(jīng)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,確定EV-71-IgY-AuNPs的最佳用量為350μL(1.3×10~(-4) g·mL~(-1)),最佳熒光恢復(fù)時(shí)間為60 min。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下,測(cè)定本方法的線性檢測(cè)范圍為10~4 PFU·mL~(-1)~5×10~6 PFU·mL~(-1)。根據(jù)檢測(cè)體系熒光值與病毒濃度呈線性關(guān)系,計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)曲線為I_(638nm)=24.364C-59.168,R~2=0.9836,判定檢出限為10~4PFU·mL~(-1),且檢測(cè)方法特異性良好,與CA16病毒無(wú)交叉反應(yīng);同時(shí),將本方法應(yīng)用于手足口病臨床糞便樣本檢測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果與EV71病毒標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法qRT-PCR對(duì)比分析,檢測(cè)方法的一致率達(dá)到90%,表明本研究建立的檢測(cè)方法可應(yīng)用于臨床樣本的檢測(cè)。3.基于CA-16-IgY和FRET原理,建立CA16型手足口病病原體檢測(cè)方法。經(jīng)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,確定CA-16-IgY-AuNPs的最佳用量為400μL(1.3×10~(-4) g·mL~(-1)),最佳NaCl用量為40μL(2 mol·L~(-1)),最佳熒光恢復(fù)時(shí)間為90 min;在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下,測(cè)定本方法的線性檢測(cè)范圍為10~4 PFU·mL~(-1)~2×10~6 PFU·mL~(-1)。根據(jù)檢測(cè)體系熒光值與病毒濃度呈線性關(guān)系,計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)曲線為I_(525nm)=15.452IgC-9.746,R~2=0.9932,判定檢出限為10~4 PFU·mL~(-1),且檢測(cè)方法特異性良好,與EV71病毒無(wú)交叉反應(yīng);同時(shí),將本方法應(yīng)用于手足口病臨床糞便樣本檢測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果與CA16病毒標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法qRT-PCR對(duì)比分析,檢測(cè)方法的一致率達(dá)到93.75%,表明本研究建立的檢測(cè)方法可應(yīng)用于臨床樣本的檢測(cè)。研究結(jié)論:1.成功制備了EV71、CA16型病毒卵黃抗體,且抗體質(zhì)量良好。2.成功制備了IgY-AuNPs,并對(duì)其尺寸,形貌和性能進(jìn)行了表征。3.成功建立了EV71、CA16型手足口病檢測(cè)方法,制備了EV71、CA16兩種手足口病病原體檢測(cè)試劑盒,僅需將經(jīng)預(yù)處理后的待檢樣本分別加入不同熒光淬滅體系中,即可實(shí)現(xiàn)一步檢測(cè),該檢測(cè)方法效果良好,可以滿足手足口病臨床樣本的快速篩查和檢測(cè)的實(shí)際需要。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R725.1;R446.6

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本文編號(hào)：2811882