研究目的:手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是由多種腸道病毒引起的常見傳染病,我國手足口病暴發(fā)流行的主要病原體為腸道病毒71型(Enterovirus71,EV71)和柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A16,CA16),由于該病毒對人群健康危害較大,因此,早期快速、特異性地監(jiān)測EV71、CA16病原體并采取有針對性的預防控制措施,現已成為公共衛(wèi)生研究的熱點問題之一。傳統(tǒng)的檢測方法存在操作復雜、耗時耗力、靈敏度低、特異性差等缺點。因此,建立一種快速、靈敏且特異性好的手足口病檢測方法十分必要。本課題旨在制備EV71、CA16型病毒卵黃抗體,并對其純度、蛋白含量、效價和特異性等指標進行效果評價;通過靜電自組裝將卵黃抗體偶聯(lián)至金納米粒子表面以制備能夠特異性識別EV71、CA16的生物探針,基于熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技術,建立一種手足口病的快速檢測方法,構建EV71、CA16兩種手足口病病原體檢測試劑盒,在實際檢測工作中,僅需將經預處理后的待檢樣本分別加入不同熒光淬滅體系中,即可實現一步檢測,應用于臨床樣本檢測中,并對該法的檢測效果進行評價。研究方法:本課題成功制備了EV71型和CA16型病毒卵黃抗體,并對這兩種抗體的純度、蛋白含量、效價、特異性進行鑒定;基于雞卵黃抗體和FRET技術,建立手足口病的快速檢測方法并應用于臨床樣本檢測中,對建立的檢測方法進行效果評價。具體研究內容如下:1.采用滅活病毒作為抗原,免疫SPF級產蛋母雞,收集雞蛋,采用聚乙二醇沉淀法分離提取雞卵黃抗體;采用SDS-PAGE方法及蛋白濃度定量試劑盒(BCA)方法測定抗體純度及蛋白含量;采用間接ELISA(iELISA)方法檢測抗體效價和特異性;2.將上述制備的EV71、CA16雞卵黃抗體通過靜電自組裝與金納米粒子偶聯(lián),制備可以特異性識別EV71、CA16的金納米生物探針。通過傅里葉變換紅外光譜(FTIR)、紫外可見光譜(UV-Vis)、透射電子顯微鏡(TEM)、動態(tài)光散射(DLS)和ZETA電位(Zeta potential)對金納米生物探針的組成、尺寸、形貌和性能進行表征。3.基于雞卵黃抗體和FRET技術構建手足口病臨床檢測體系。應用上述制備的金納米生物探針和量子點構建熒光淬滅體系,加入不同濃度的待檢病毒后,采用熒光分光光度計檢測體系熒光值,建立熒光強度與病毒濃度的線性回歸方程,從而實現手足口病臨床樣本的定性、定量檢測。通過優(yōu)化檢測體系IgY-AuNPs用量、NaCl用量、熒光恢復時間等指標,對檢測方法的靈敏度、特異性進行評價,構建EV71、CA16兩種手足口病病原體檢測試劑盒,在實際檢測工作中,僅需將經預處理后的待檢樣本分別加入不同熒光淬滅體系中,即可實現兩種病原體的定性、定量檢測,滿足手足口病臨床樣本的快速篩查和檢測的實際需要。研究結果:1.本實驗制備的EV71、CA16型病毒卵黃抗體純度較好,輕重鏈分明,條帶清晰,無其他明顯雜帶;EV-71-IgY平均蛋白含量為26.60 mg·L~(-1),抗體最高效價為1:512000;CA-16-IgY平均蛋白含量為12.15 mg·L~(-1);抗體最高效價為1:128000;兩種雞卵黃抗體特異性均良好,能特異性識別靶病毒而不與干擾物結合。2.基于EV-71-IgY和FRET原理,建立EV71型手足口病病原體檢測方法。經優(yōu)化實驗條件,確定EV-71-IgY-AuNPs的最佳用量為350μL(1.3×10~(-4) g·mL~(-1)),最佳熒光恢復時間為60 min。在最優(yōu)實驗條件下,測定本方法的線性檢測范圍為10~4 PFU·mL~(-1)~5×10~6 PFU·mL~(-1)。根據檢測體系熒光值與病毒濃度呈線性關系,計算得標準曲線為I_(638nm)=24.364C-59.168,R~2=0.9836,判定檢出限為10~4PFU·mL~(-1),且檢測方法特異性良好,與CA16病毒無交叉反應;同時,將本方法應用于手足口病臨床糞便樣本檢測,實驗結果與EV71病毒標準檢測方法qRT-PCR對比分析,檢測方法的一致率達到90%,表明本研究建立的檢測方法可應用于臨床樣本的檢測。3.基于CA-16-IgY和FRET原理,建立CA16型手足口病病原體檢測方法。經優(yōu)化實驗條件,確定CA-16-IgY-AuNPs的最佳用量為400μL(1.3×10~(-4) g·mL~(-1)),最佳NaCl用量為40μL(2 mol·L~(-1)),最佳熒光恢復時間為90 min;在最優(yōu)實驗條件下,測定本方法的線性檢測范圍為10~4 PFU·mL~(-1)~2×10~6 PFU·mL~(-1)。根據檢測體系熒光值與病毒濃度呈線性關系,計算得標準曲線為I_(525nm)=15.452IgC-9.746,R~2=0.9932,判定檢出限為10~4 PFU·mL~(-1),且檢測方法特異性良好,與EV71病毒無交叉反應;同時,將本方法應用于手足口病臨床糞便樣本檢測,實驗結果與CA16病毒標準檢測方法qRT-PCR對比分析,檢測方法的一致率達到93.75%,表明本研究建立的檢測方法可應用于臨床樣本的檢測。研究結論:1.成功制備了EV71、CA16型病毒卵黃抗體,且抗體質量良好。2.成功制備了IgY-AuNPs,并對其尺寸,形貌和性能進行了表征。3.成功建立了EV71、CA16型手足口病檢測方法,制備了EV71、CA16兩種手足口病病原體檢測試劑盒,僅需將經預處理后的待檢樣本分別加入不同熒光淬滅體系中,即可實現一步檢測,該檢測方法效果良好,可以滿足手足口病臨床樣本的快速篩查和檢測的實際需要。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R725.1;R446.6

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本文編號：2811882