【摘要】：酶聯(lián)免疫吸附和免疫組化是生物分析和臨床診斷中經(jīng)典的檢測手段,但是這兩種方法由于靈敏度較低,并不能滿足發(fā)病初期對病原標(biāo)志物的診斷。本論文主要是針對這兩種免疫分析方法進(jìn)行信號放大系統(tǒng)構(gòu)建,提高檢測靈敏度:1)基于重復(fù)單元信號放大體系制備AuNP-PAMAM聚集體用于絨毛膜促性腺激素(hCG);2)基于納米酶與生物酶雙催化作用提升免疫分析中的信號,并采用hCG進(jìn)行了響應(yīng)信號的研究;3)構(gòu)建高催化活性的Pd-Ru-Ir三元金屬納米酶體系,并應(yīng)用于免疫組化研究中,響應(yīng)信號提升8.7倍。1、采用生物素和巰基化的PAMAM聚合物誘導(dǎo)納米金聚集,并且與抗體偶聯(lián),形成一種類項(xiàng)鏈狀的聚集體AuNP-PAMAM探針,該聚集體由多個(gè)納米金重復(fù)結(jié)構(gòu)單元組成,平均粒徑達(dá)156 nm。將探針用于hCG的檢測,線性區(qū)間為0.10-6.40 IU/L,靈敏度高達(dá)0.03 IU/L,與傳統(tǒng)的BA-ELISA(0.8 IU/L)和經(jīng)典的納米金為載體的熒光探針(0.6IU/L)進(jìn)行比較,AuNP-PAMAM探針靈敏度具有明顯優(yōu)勢優(yōu)勢。2、構(gòu)建了納米酶和HRP雙催化的Au@Pt-HRP探針,將該探針用于檢測hCG,靈敏度高達(dá)0.10 IU/L,線性區(qū)間是0.40-12.80 IU/L,與BA-ELISA相比較而言,優(yōu)勢較明顯,靈敏度提升近8倍。對于Au@Pt納米酶表面結(jié)合的HRP進(jìn)行了計(jì)算,結(jié)果表明,21-22個(gè)HRP分子能結(jié)合在Au@Pt納米酶表面,超出傳統(tǒng)的信號放大載體納米金能結(jié)合的HRP分子數(shù)(11-12)。3、對于中空(Ag-Pt,Ag-Pd)和多孔狀(Pd-Pt)等三種納米酶的催化活性進(jìn)行了研究:多孔Pd-Pt納米酶在TMB-H_2O_2的催化體系中活性最強(qiáng)�；陔p催化探針的觀念,合成了Pd-Pt-HRP探針,用于檢測hCG,靈敏度高達(dá)0.07 IU/L。并通過XPS和TEM表征及氮吸附脫附實(shí)驗(yàn)等手段證明HRP分子能夠進(jìn)入Pd-Pt表面的孔道中。進(jìn)一步的對該納米酶表面的HRP分子數(shù)量做了計(jì)算,約31-32個(gè)酶分子能結(jié)合上該納米酶。最后對納米酶的兩種基礎(chǔ)晶面進(jìn)行了合成,Pd-Pt八面體((111)晶面)納米酶在催化作用中占據(jù)優(yōu)勢。4、對鉑系金屬中的四種貴金屬(Rh、Ru、Pt和Ir)的催化性能做了比較,Ir更適合TMB-H_2O_2體系。并在此基礎(chǔ)上,合成了三元金屬Pd-M-Ir(M=Rh、Ru和Au),對于Ir元素而言,在TMB-H_2O_2的催化體系中,催化活性隨著d-band中心的下降而上升,將活性最高的Pd-Ru-Ir納米酶應(yīng)用于免疫組化中,所得到的光密度平均值高于商業(yè)化免疫組化信號8.7倍。
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R446.6
【圖文】：

境分析等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。在臨床上，常用于生物標(biāo)志物的，免疫分析法主要是利用抗體對抗原的識別作用，同時(shí)在抗體上號分子的信號輸出強(qiáng)度對生物標(biāo)志物的濃度進(jìn)行檢測。根據(jù)信號分析法主要分為以下幾個(gè)大類：放射性免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫析[2]、膠體金免疫技術(shù)[3]、免疫組化和酶聯(lián)免疫吸附（ELISA)。A 最為常用，ELISA 常作為檢測生物標(biāo)志物的金標(biāo)準(zhǔn)。免疫吸附 是免疫分析方法測定中的金標(biāo)準(zhǔn)，歷經(jīng)近半個(gè)世紀(jì)的發(fā)展，是在的生物標(biāo)志物的分析手段。該技術(shù)操作簡便、快速、易于標(biāo)準(zhǔn)化用的分析手段之一。酶聯(lián)免疫吸附中，一般以堿性磷酸酶，辣根ish Peroxidase；HRP）做為標(biāo)記抗體的酶。HRP 標(biāo)記抗體，以雙物標(biāo)志物，雙抗夾心 ELISA 的基本過程如下圖所示（圖 1-1）。

華南理工大學(xué)博士學(xué)位論文用于 ELISA 作為顯色試劑，并且通常是評價(jià)酶性能的底物；DAB-H2O2體系中，在有納米酶測存在下，底物能被迅速催化氧化顯暗棕色，且能觀察到有棕色沉淀產(chǎn)生，由于催化產(chǎn)物的溶解性較低，通常被氧化之后會結(jié)晶析出，沉積在細(xì)胞或者組織表面，起到定位作用，因此該類催化底物通常用于免疫組化中；OPD-H2O2體系中，在有 HRP 的存在下，底物能被迅速催化氧化顯紅棕色，氧化產(chǎn)物在 446 nm 處有比較明顯的紫外吸收峰，該試劑也曾被用于ELISA中，但是氧化產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)相對較低（16700 M 1cm 1）所以逐漸被 TMB 所取代[8]；與其他蛋白質(zhì)一樣，HRP 的活性也受很多因素的影響，pH和溫度就是比較典型的影響因素，另外，一些小分子物質(zhì)，例如疊氮化鈉和氟化物等，也會對 HRP 的催化活性起到抑制作用。

也曾被用于ELISA中，但是氧化產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)相對較低（16700 M 1漸被 TMB 所取代[8]；與其他蛋白質(zhì)一樣，HRP 的活性也受很多因素的影就是比較典型的影響因素，另外，一些小分子物質(zhì)，例如疊氮化鈉和氟 HRP 的催化活性起到抑制作用。圖 1-2 辣根過氧化物酶的結(jié)構(gòu)圖（a）以及活性中心（b）Figure 1-2 The structure diagram of HRP (a) and the active center (b)

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本文編號：2805309