【摘要】：目的構(gòu)建IL-6過表達(dá)慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,探討其對HBsAg、HBeAg、HBV-DNA表達(dá)影響。方法以Huh7細(xì)胞gDNA為模板,通過PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得IL-6片段并克隆到pMIGR1載體上,測序鑒定正確后,分別用pMIGR1質(zhì)粒和pMIGR1-IL-6質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒pCL-10A1共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,獲得重組慢病毒顆粒,分別感染Huh7細(xì)胞,嘌呤霉素篩選出成功表達(dá)IL-6的陽性細(xì)胞,分別命名為Huh7/con和Huh7/IL-6,電化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6表達(dá)水平;qRT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞中IL-6 mRNA表達(dá)水平;化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測技術(shù)檢測HBsAg、HBeAg表達(dá)水平,PCR-熒光探針法檢測HBV-DNA表達(dá)水平。結(jié)果通過測序驗(yàn)證成功構(gòu)建pMIGR1-IL-6質(zhì)粒;通過慢病毒介導(dǎo)成功篩選出Huh7/con和Huh7/IL-6細(xì)胞系;電化學(xué)發(fā)光法及qRT-PCR結(jié)果顯示,與對照組Huh7/con細(xì)胞系相比,Huh7/IL-6細(xì)胞系培養(yǎng)上清IL-6水平及細(xì)胞中IL-6 mRNA水平顯著升高;pcDNA1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7、HepG2、Huh7/IL-6細(xì)胞6、12、24、48 h后上清中IL-6表達(dá)水平顯著升高;20 ng/ml IL-6處理pcDNA1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的Huh7和HepG2細(xì)胞6、12、24、48 h后上清液中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA表達(dá)水平顯著下降;pcDNA1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7/IL-6細(xì)胞6、12、24、48 h后上清中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA表達(dá)水平顯著下降。結(jié)論成功構(gòu)建IL-6慢病毒表達(dá)載體,并建立穩(wěn)定過表達(dá)IL-6的Huh7細(xì)胞系;pcDNA1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可使IL-6表達(dá)上調(diào);IL-6可使HBsAg、HBeAg、HBV-DNA表達(dá)水平下降。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R512.62;R440
【圖文】：

圖1 PCR獲得IL-6片段M：Marker；1～8：57、58、59、60、61、62、63、64 ℃目的基因溫度梯度PCR結(jié)果3.2 MIGR1-IL-6慢病毒載體質(zhì)粒酶切及測序鑒定 目的基因PCR引物序列兩端分別添加BglⅡ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)序列，PCR技術(shù)擴(kuò)增酶切后，與pMIGR1連接，用限制性內(nèi)切酶BglⅡ和EcoRⅠ酶切重組質(zhì)粒，結(jié)果顯示目的基因與載體被切開，如圖3A所示。將酶切結(jié)果正確的菌液進(jìn)行測序，測序結(jié)果完全符合，無突變。表明IL-6慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功，如圖3B、3C所示。

圖2 pMIGR1載體雙酶切以及pMIGR1與IL-6連接產(chǎn)物測序結(jié)果A：載體質(zhì)粒雙酶切結(jié)果；M：Marker；1：pMIGR1載體原質(zhì)粒；2：pMIGR載體雙酶切后質(zhì)粒；B：重組質(zhì)粒測序結(jié)果序列圖；C：重組質(zhì)粒測序結(jié)果峰圖3.3 電化學(xué)發(fā)光法檢測Huh7/con和Huh7/IL-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系上清中IL-6表達(dá)水平 使

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文32圖3 電化學(xué)發(fā)光法檢測Huh7/IL-6細(xì)胞上清中IL-6的表達(dá)情況與Huh7/con組比較：****P<0.000 13.4 qRT-PCR檢測Huh7/con和Huh7/IL-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中IL-6的mRNA水平 采用qRT-PCR 檢測 Huh7/con 和 Huh7/IL-6 細(xì)胞系 IL-6 mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果顯示Huh7/IL-6細(xì)胞系IL-6表達(dá)水平較Huh7/con升高約600倍（t=19.8，P<0.000 1），如圖4所示。圖4 qRT-PCR檢測Huh7/IL-6細(xì)胞上清中IL-6的表達(dá)情況與Huh7/con組比較：****P<0.000 13.5 pcDNA1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞48h后不同時(shí)間段細(xì)胞上清中IL-6表達(dá)水平pcDNA1

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本文編號：2804023