【摘要】：隨著超顯微技術(shù)、二代測序技術(shù)以及新的菌培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展,研究人員發(fā)現(xiàn)健康人和疾病患者的血液和血細(xì)胞內(nèi)存在一定量的細(xì)菌,這些細(xì)菌具有休眠和不可培養(yǎng)的特點(diǎn)。采用基于16S rRNA基因測序技術(shù)可以有效檢測這些休眠菌的存在,并研究血細(xì)胞菌群結(jié)構(gòu)與疾病的關(guān)系。目前文獻(xiàn)已報(bào)道一些患有慢性疾病和老年性疾病如:II型糖尿病、心血管疾病、阿爾茲海默癥、帕金森等的患者血液中都存在異常的微生物菌群。骨質(zhì)疏松是老年人常見的一種骨退行性病變,是以骨量降低,骨架構(gòu)完整性破壞、骨脆性增加為特征的全身性骨病,骨量受年齡、環(huán)境、激素水平、營養(yǎng)、免疫等多種因素調(diào)節(jié),近年來研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群是骨量的重要調(diào)節(jié)因素。由于很多慢性疾病血液樣本中含有細(xì)菌,因此如果能在骨質(zhì)疏松患者血液中檢測到與骨量相關(guān)的菌群,將為研究骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制以及血細(xì)胞菌群對骨量的影響提供新的線索。目的:本實(shí)驗(yàn)利用16S rRNA基因測序技術(shù)研究骨質(zhì)疏松患者血細(xì)胞沉淀中的菌群結(jié)構(gòu)特點(diǎn),分析優(yōu)勢菌種與臨床指標(biāo)的關(guān)系,確定血液菌群與骨質(zhì)疏松癥具有相關(guān)性。方法:1.選取符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)的骨退行性病變伴有骨質(zhì)疏松患者8例(ST組)、骨退行性病變無骨質(zhì)疏松患者12例(T組),健康人4例(N組)。收集患者血常規(guī)血樣以及生物化學(xué)、血常規(guī)、尿常規(guī)等檢測報(bào)告,用于研究菌群與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析。2.收集血細(xì)胞沉淀,提取總基因組DNA,16S rRNA基因V4區(qū)擴(kuò)增,使用Illumina HiSeq測序。3.生物信息學(xué)分析:包括OTU生成,測序數(shù)據(jù)質(zhì)控,菌群多樣性,骨質(zhì)疏松患者血細(xì)胞沉淀中相對豐度值Top10的菌屬和菌種在三組樣本中的變化規(guī)律以及血細(xì)胞沉淀中菌種的相對豐度值與臨床指標(biāo)的相關(guān)性。生物信息學(xué)分析工具為QIIME分析平臺及R相關(guān)工具包:pcoa.plot、ggplot、Anova、corrplot、Hmisc等。結(jié)果1.24份血細(xì)胞沉淀樣本中均含有細(xì)菌,提示骨退行性疾病患者和健康人血細(xì)胞沉淀中都含有細(xì)菌。2.血細(xì)胞沉淀中檢測出的序列總數(shù)、注釋得到的OTU數(shù)目以及注釋上OTU的樣本序列總數(shù)均與血液中性粒細(xì)胞數(shù)目呈中等程度正相關(guān),提示部分細(xì)菌可能來自是中性粒細(xì)胞內(nèi)部,或者是黏貼在粒細(xì)胞表面。3.三組樣本血細(xì)胞沉淀中的菌群多樣性分析與比較顯示,門分類水平上ST組的菌群結(jié)構(gòu)為:Proteobacteria(變形菌門,42%),Firmicutes(厚壁菌門,28%),Bacteroidetes(擬桿菌門,14%),Actinobacteria(放線菌門,4%),Deinococcus-Thermus(異常球菌數(shù)-棲熱菌門,3%),Acidobacteria(酸桿菌門,2%),Gemmatimonadetes(單芽胞菌門,2%),Chloroflexi(綠彎菌門,1%),其它菌(4%)。在菌屬水平上,ST組菌群多樣性有所增加,且均勻度增強(qiáng),Simpson指數(shù)顯示三組間的菌群多樣性有顯著性差異(p=0.0164)。4.骨質(zhì)疏松患者血細(xì)胞沉淀中相對豐度值Top10菌屬在三組樣本中的變化規(guī)律:有4個(gè)菌屬的相對豐度變化在三組樣本間差異顯著:Yersinia(耶爾森菌屬)和Enterobacter(腸桿菌屬)在骨退行性病變尤其是伴有骨質(zhì)疏松時(shí)豐度值偏高(p0.05);但Lachnospiraceae(毛螺菌屬)和Prevotellaceae(普雷沃氏菌屬)則相反,在骨發(fā)生退行性病變尤其是伴有骨質(zhì)疏松時(shí)相對豐度值則變低(p0.05)。5.骨質(zhì)疏松患者血細(xì)胞沉淀中相對豐度值Top10菌種在三組樣本中的變化規(guī)律:有4個(gè)菌種在骨質(zhì)疏松發(fā)生時(shí)相對豐度值增高:Yersinia ruckeri、Enterobacter spp.、Rhodanobacter_uncultured_bacterium和Raoultella spp.(p0.05),其余6個(gè)菌種相對豐度值在三組樣本中無明顯差異。6.骨質(zhì)疏松組的4個(gè)變化菌種與24個(gè)樣本的83個(gè)臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)Yersinia ruckeri、Rhodanobacter_uncultured_bacterium、Enterobacter spp.和Raoultella spp.與臨床多種指標(biāo)相關(guān)。這些指標(biāo)包括已知的與骨代謝密切相關(guān)的因素:血清磷和年齡;以及近幾年新發(fā)現(xiàn)的與骨量相關(guān)的血清學(xué)指標(biāo):總膽紅素、淋巴細(xì)胞、血尿酸等。結(jié)論:骨質(zhì)疏松患者血細(xì)胞沉淀中菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變,其中4種細(xì)菌與臨床多種骨量相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)相關(guān),提示這些細(xì)菌的增多可能與骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R580;R446.5
【圖文】：

大連醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文松患者 12 例(T 組)，健康人 4 例(N 組)，按照菌 DNA 提取方法，總DNA。經(jīng)過 Nanodrop檢測，每份樣本血細(xì)胞沉淀中的 DNA濃度均測序所需的最低濃度標(biāo)準(zhǔn)（圖 1A）, 瓊脂糖凝膠電泳顯示 DNA 1B）。利用細(xì)菌的 V4 通用引物對各樣本進(jìn)行 16S rRNA 基因 PCR血細(xì)胞沉淀樣本中均含有菌 16S rRNA 基因擴(kuò)增產(chǎn)物（圖 2）。

12圖 2 24 份血細(xì)胞沉淀的 16S rRNAV4 區(qū) PCR 擴(kuò)增結(jié)果PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示 24 份樣本都存在菌 16S rRNA 基因（M：DNA Marker）測序數(shù)據(jù)質(zhì)控分析結(jié)果24 份樣本經(jīng)過 v4 可變區(qū)域測序后得到的每一條序列，根據(jù)指定的相似度，進(jìn)作，即 OTU 劃分，得到每一個(gè)樣品中的菌種、菌屬等數(shù)目信息（表 3）。通

圖 3 24 個(gè)樣本 Shannon-Winner 曲線分析代表一個(gè)樣品，用不同顏色標(biāo)記，末端數(shù)字為實(shí)際測序條數(shù)； 起初曲線直數(shù)遠(yuǎn)不足覆蓋樣品導(dǎo)致； 數(shù)值升高直至平滑說明該實(shí)驗(yàn)測序條數(shù)足以覆蓋大部分微生物。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Giulia Malaguarnera;Maria Giordano;Giuseppe Nunnari;Gaetano Bertino;Michele Malaguarnera;;Gut microbiota in alcoholic liver disease: Pathogenetic role and therapeutic perspectives[J];World Journal of Gastroenterology;2014年44期

本文編號：2803630