【摘要】：【研究背景】腹膜透析是基于腹膜生物性半透膜的特性,高糖腹透液與腹膜毛細血管內(nèi)血液進行物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運,從而實現(xiàn)血液凈化的目的。隨著手術(shù)方式和腹膜透析裝置的改進,導管相關(guān)的感染和非感染并發(fā)癥已顯著下降,這種情況下,腹膜纖維化就成為長期腹膜透析面臨的最大挑戰(zhàn),腹膜纖維化可引起透析效能下降和超濾衰竭,最終導致腹膜透析失敗,病人需轉(zhuǎn)為其他腎臟替代治療。近些年,研究報道了大量關(guān)于腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化新的分子和調(diào)控機制,提示在纖維化的早期可能存在潛在的干預位點,但想實現(xiàn)臨床上靶向治療還遠遠不夠。X-盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein,XBP1)是肌醇需要酶1(inositol reruiring enzyme 1,IRE1)下游關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,它通過與靶基因啟動子序列中的X盒結(jié)合,激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。IRE1/XBP是未折疊蛋白反應(yīng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(unfolded protein response,URP/endoplasmic reticulum stress,ERS)中一條重要的信號通路。XBP1s在細胞生長和分化、蛋白分泌、細胞凋亡中具有重要的調(diào)控作用。參與了胰島細胞與唾液腺的分泌、胚胎肝臟的發(fā)育以及淋巴細胞的生長分化。文獻報道,XBP1s與多種纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展,如支氣管囊性纖維、特發(fā)性肺纖維化、硬皮病、肝臟纖維化等有密切聯(lián)系,XBP1s在人腹膜間皮細胞(human peritoneal mesothelial,HPMCs)和腹膜纖維化中的作用尚未見報道。我們課題組前期預實驗發(fā)現(xiàn),XBP1s通過激活JNK信號通路,參與介導了炎性因子誘導的HPMCs的炎癥反應(yīng),并且發(fā)現(xiàn)XBP1s抑制劑的使用可以減輕炎癥誘導的腹膜纖維化。但XBP1s在高糖刺激的腹膜間皮細胞纖維化中的作用及分子機制如何尚不清楚,需要更進一步的研究來證明�！灸康摹�1.檢測不同透齡腹膜透析患者腹膜透析流出液細胞中XBP1s表達水平與纖維化相關(guān)分子的表達,初步探討XBP1s與腹膜纖維化的相關(guān)性。2.尋找人腹膜間皮細胞HPMCs在高糖刺激下XBP1s表達水平與纖維化相關(guān)分子表達的相關(guān)性。3.通過過表達和敲低XBP1s觀察其對纖維化相關(guān)分子表達的影響,從而從細胞水平驗證XBP1s對腹膜纖維化的調(diào)控作用�！痉椒ā�1.取持續(xù)不臥床腹膜透析(Continuous Ambulatory Peritoneal Dialysis,CAPD)患者夜間留腹透析液分離培養(yǎng)流出液細胞,通過qRT-PCR和Western blot技術(shù)分別檢測XBP1s及上皮細胞表型標志E-cadherin、纖維化標志分子α-SMA、Vimentin、CollagenⅠ、Fibronectin、TGF-β、CTGF的mRNA及蛋白表達情況;2.利用120mM葡萄糖刺激人HPMCs,通過qRT-PCR、Western blot和免疫熒光技術(shù)分別檢測XBP1s及上皮細胞表型標志E-cadherin、纖維化標志分子α-SMA、Vimentin、CollagenⅠ、Fibronectin、TGF-β、CTGF的mRNA及蛋白表達情況;3.利用XBP1s過表達和shRNA慢病毒感染人HPMCs,建立過表達和干擾細胞系,再給予高糖刺激,觀察纖維化相關(guān)分子表達情況;4.利用XBP1s過表達和shRNA慢病毒感染CAPD患者腹透液流出細胞中HPMCs,觀察纖維化相關(guān)分子表達情況。【結(jié)果】1.隨著透齡的延長,腹透液流出細胞的形態(tài)由鋪路石樣向梭形轉(zhuǎn)變的趨勢。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,隨著透齡的延長,XBP1s mRNA及蛋白表達均增加;上皮細胞表型標志E-cadherin表達降低,而成纖維細胞表型標志α-SMA、Vimentin、CollagenⅠ、Fibronectin、TGF-β、CTGF等表達增加。2.在高糖刺激的HPMCs中,qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,XBP1s表達增加,同時上皮細胞表型標志E-cadherin表達隨著刺激時間的延長而降低,而成纖維細胞表型標志α-SMA、Vimentin、CollagenⅠ、Fibronectin、TGF-β、CTGF等表達增加。3.用慢病毒感染方法分別建立了過表達和干擾人HPMCs細胞系,感染效率均能達到或超過80%。過表達XBP1s可以顯著增強高糖刺激下上皮細胞表型標志E-cadherin表達的下調(diào),以及成纖維細胞表型標志α-SMA、Vimentin、CollagenⅠ、Fibronectin、TGF-β、CTGF等表達的增加。干擾XBP1s可以顯著抑制高糖刺激下上皮細胞表型標志E-cadherin表達的下調(diào),以及成纖維細胞表型標志α-SMA、Vimentin、CollagenⅠ、Fibronectin、TGF-β、CTGF等表達的增加。4.用慢病毒感染方法分別建立了過表達和干擾人原代腹膜間皮細胞(CAPD患者腹透液流出細胞分離培養(yǎng)所得),感染效率均能達到或超過80%。實驗結(jié)果與結(jié)果3相同�！窘Y(jié)論】隨著透齡的延長,CAPD患者腹膜間皮細胞由上皮細胞向成纖維細胞轉(zhuǎn)變,XBP1s的表達與這一現(xiàn)象呈顯著正相關(guān);通過細胞系和原代人HPMCs過表達及敲低XBP1s發(fā)現(xiàn),XBP1s介導高糖刺激的人HPMCs由上皮細胞向成纖維細胞轉(zhuǎn)變。這些發(fā)現(xiàn)證明XBP1s是腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化的重要分子之一,為未來治療腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化提供了潛在的治療靶分子。
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R459.5
【圖文】：

圖 1-1 腹透流出液細胞形態(tài)學改變（×200）（A）透齡 6 個月的腹透流出液細胞形態(tài)；（B）透齡 12 個月的腹透流出液細胞形態(tài)；（C）透齡 33 個月的腹透流出液細胞形態(tài)；（D）透齡 45 個月的腹透流出液細胞形態(tài).2 腹膜透析流出液細胞中 XBP1s 表達以β-actin 為內(nèi)參，qRT-PCR 結(jié)果表明：隨著透齡的延長，XBP1s 的表達增加（P<0.01），（圖 1-2 A）。Western blot 結(jié)果同樣顯示隨著透齡的延長，XBP表達增加（P<0.05），（圖 1-2 B C）。圖 1-2 腹透流出液細胞中 XBP1s 表達情況

圖 1-1 腹透流出液細胞形態(tài)學改變（×200）（A）透齡 6 個月的腹透流出液細胞形態(tài)；（B）透齡 12 個月的腹透流出液細胞形態(tài)；（C）透齡 33 個月的腹透流出液細胞形態(tài)；（D）透齡 45 個月的腹透流出液細胞形態(tài)；3.2 腹膜透析流出液細胞中 XBP1s 表達以β-actin 為內(nèi)參，qRT-PCR 結(jié)果表明：隨著透齡的延長，XBP1s 的表達明顯增加（P<0.01），（圖 1-2 A）。Western blot 結(jié)果同樣顯示隨著透齡的延長，XBP1s的表達增加（P<0.05），（圖 1-2 B C）。

圖 2-1 高糖刺激人 HPMCs 中 XBP1s 表達情況A: 高糖刺激的 HPMCs 中 XBP1s mRNA 表達情況，*P<0.05，**P<0.01；B: 高糖刺激的HPMCs 中 XBP1s 蛋白表達情況；3.2 高糖刺激人 HPMCs 中纖維化相關(guān)分子表達情況通過 qRT-PCR 和 Western blot，檢測了細胞纖維化相關(guān)分子，qRT-PCR 結(jié)果提示：上皮細胞表型標志 E-cadherin 表達隨著刺激時間的延長而降低，而成纖維細胞標志分子α-SMA、Vimentin、Collagen Ⅰ、Fibronectin、TGF-β、CTGF 等表達增加，如圖 2-2 A 所示。蛋白的表達變化基本上與 mRNA 變化一致，如圖 2-2B 所示。

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本文編號：2796528