【摘要】：目的研究細(xì)菌對地塞米松類甾體激素的降解作用及其分子機(jī)制,為構(gòu)建清除水環(huán)境醫(yī)源性地塞米松類藥物污染的工程菌奠定基礎(chǔ)。方法采用富集培養(yǎng)法從醫(yī)院廢水中分離降解地塞米松的細(xì)菌,采用固相萃取-高效液相色譜(HPLC)法檢測細(xì)菌對地塞米松的降解效能,通過16S r DNA序列測定進(jìn)行鑒定。用Illumina Hiseq4000結(jié)合第三代測序技術(shù)對降解菌的全基因組測序,并進(jìn)行序列組裝、注釋和分析,對降解地塞米松相關(guān)基因進(jìn)行RT-q PCR驗(yàn)證。結(jié)果分離到1株對地塞米松有較高降解作用的細(xì)菌,經(jīng)鑒定屬于伯克霍爾德菌屬(Burkholderia),命名為Burkholderia sp.CQ001。該菌對地塞米松磷酸鈉及地塞米松的降解率分別為84.8%和77.11%。全基因組測序表明Burkholderia sp.CQ001包含2條染色體和4個(gè)巨型質(zhì)粒,與代謝相關(guān)基因大部分集中在2號(hào)染色體上,共3 260 157 bp。生物信息學(xué)分析表明,該菌含有甾體代謝通路中許多重要酶類的編碼基因,其中與地塞米松降解相關(guān)的有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子,3-甾酮-9α-脫氫酶等,這些基因在以地塞米松磷酸鈉為碳源的培養(yǎng)條件下表達(dá)量不同程度地高于以蔗糖為碳源的培養(yǎng)條件。結(jié)論 Burkholderia sp.CQ001是一株具有強(qiáng)大的代謝功能和代謝途徑豐富的細(xì)菌,具有降解地塞米松類甾體激素的性能,該菌株為后續(xù)研究甾體激素的降解機(jī)制和構(gòu)建清除水環(huán)境醫(yī)源性地塞米松類藥物污染的工程菌提供了菌種。
【圖文】：

TCACTGCGGCTCGAACACKshB1正義ATGAGCGATTCGCGCTTC反義TCAGTCGGGAAACACCACGKshB2正義GTGGACAGCCGGGTCAC反義CTACTTGTCGATCACGAGATCCABC正義ATGGAAAACAAATCACATGCGTTC反義TCACTGCCCGGCCGTCG2結(jié)果2．1地塞米松降解菌的分離和鑒定從醫(yī)院廢水中分離到一株能降解地塞米松磷酸鈉和地塞米松的細(xì)菌，該菌在在LB瓊脂平板上形成中等大小(d=1．52．0mm)、圓形、表面光滑濕潤、邊緣整齊、易挑起的淺黃色不透明菌落。涂片革蘭染色后油鏡下觀察為革蘭陰性桿菌，菌體呈直的或略為彎曲的桿狀，(6～15)μm×(4～15)μm大小(圖1)。經(jīng)16srDNA序列鑒定，初步確定該菌屬于伯克霍爾德菌屬(Burk-holderia)，命名為Burkholderiasp．CQ001。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建發(fā)現(xiàn)，在物種進(jìn)化水平上，該菌株的16SrRNA序列與BurkholderiacontaminansJ2956的同源性最高。A:革蘭染色×1000;B:掃描電鏡×4000圖1分離菌的菌落特征、形態(tài)和染色性2．2Burkholderiasp．CQ001對地塞米松的降解特性通過HPLC檢測發(fā)現(xiàn)Burkholderiasp．CQ001能將地塞米松磷酸鈉先降解為地塞米松后再將地塞米松降解為其他物質(zhì)，在pH7．5的地塞米松磷酸鈉培養(yǎng)液中，37℃震蕩培養(yǎng)約24h出現(xiàn)降解高峰，對地塞米松磷酸鈉及地塞米松的總降解率分別為84．8%和77.11%(圖2)。1354第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，39(13)http://aammt．tmmu．edu．cn

圖2Burkholderiasp．CQ001對地塞米松磷酸鈉和地塞米松的降解曲線2．3Burkholderiasp．CQ001全基因組測序結(jié)果Burkholderiasp．CQ001全基因組測序結(jié)果已上傳至GenBank，登錄號(hào)為PRJNA329146。該菌株包含2條染色體和4個(gè)巨型質(zhì)粒，1號(hào)染色體基因組全長3735298bp，2號(hào)染色體基因組全長3260157bp。4個(gè)巨型質(zhì)粒的基因組長度分別為1537783bp，385838bp，97411bp，2873bp�；蚪M結(jié)果的信息統(tǒng)計(jì)見表2所示。其全基因組序列與Burkholderiaviet-namiensisG4的親緣關(guān)系最為接近。與代謝相關(guān)基因大部分集中在2號(hào)染色體上。根據(jù)所測基因序列繪制2號(hào)染色體的基因組模式圖(圖3)，其中，第1圈和第2圈為正鏈、負(fù)鏈上的CDS，不同的顏色表示不同的COG功能分類;第3圈為rRNA和tRNA;第四圈為GC含量;最內(nèi)1圈為GCskew值。表2菌株CQ001基因組基本信息統(tǒng)計(jì)表基因組信息數(shù)據(jù)基因數(shù)目8758基因總長度7660596bp基因平均長度874bp基因密度0．971基因/kb基因區(qū)域GC含量(%)66．9基因/基因組(%)84．9屬間區(qū)域長度1358764bp屬間區(qū)域GC含量(%)61．0屬間長度/基因組(%)15．12．4Burkholderiasp．CQ001的基因功能注釋和分類將Burkholderiasp．CQ001基因組中與代謝相關(guān)的8758個(gè)編碼基因與數(shù)據(jù)庫blaste比對后獲得COG、GO、KEGG基因功能注釋(圖4)。在與COG數(shù)據(jù)庫比對后，有69．8%的編碼基因得到功能分類(圖4A)，其中，與能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換(C)相關(guān)的基因有408個(gè)，與碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝(G)相關(guān)的基因有396個(gè)，與次生代謝產(chǎn)物合成、運(yùn)輸和分解(Q)相關(guān)的基因262個(gè)。與KEGG數(shù)據(jù)庫比對分析表明(圖4C)，在該菌可進(jìn)行的117條代謝通路中，涉及一條甾體代謝通路(圖5)，其中含有8個(gè)與編碼甾類化合物代謝相關(guān)的攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和5種降解關(guān)鍵酶的基因(表3)。以上分析表明Bu

類(圖4A)，其中，與能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換(C)相關(guān)的基因有408個(gè)，與碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝(G)相關(guān)的基因有396個(gè)，與次生代謝產(chǎn)物合成、運(yùn)輸和分解(Q)相關(guān)的基因262個(gè)。與KEGG數(shù)據(jù)庫比對分析表明(圖4C)，在該菌可進(jìn)行的117條代謝通路中，涉及一條甾體代謝通路(圖5)，其中含有8個(gè)與編碼甾類化合物代謝相關(guān)的攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和5種降解關(guān)鍵酶的基因(表3)。以上分析表明Burkholderiasp．CQ001是一株具有強(qiáng)大的代謝功能和代謝途徑豐富的細(xì)菌，可為進(jìn)一步研究細(xì)菌對甾類化合物的降解機(jī)制和開發(fā)具有應(yīng)用價(jià)值的工程菌提供豐富的資源。圖3Burkholderiasp．CQ001的2號(hào)染色體基因組模式圖2．5地塞米松降解相關(guān)基因的功能驗(yàn)證從Burkholderiasp．CQ001基因組中篩選出的可能與降解甾類化合物相關(guān)的部分關(guān)鍵基因，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)闡述的甾體多步降解反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制［10，13－14］，結(jié)合地塞米松的化學(xué)結(jié)構(gòu)，推測該菌株在降解地塞米松的過程中，其甾核開環(huán)可能僅僅涉及KSH這一雙組分酶的作用。用RT-qPCR檢測可能涉及地塞米松降解相關(guān)基因的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，在以地塞米松磷酸鈉為碳源的條件下培養(yǎng)24h，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子，KshA，KshB表達(dá)量不同程度地高于以蔗糖為碳源的培養(yǎng)條件，其中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子的增高最為顯著，增加20．53倍(圖6)。表明這些基因的表達(dá)均參與了地塞米松的降解，推測KshA及KshB1應(yīng)屬于地塞米松強(qiáng)烈誘導(dǎo)型加氧酶及還原酶，而KshB2對地塞米松的刺激沒有B1敏感，這可能與KstR2的調(diào)控機(jī)制有關(guān)［15］。http://aammt．tmmu．edu．cn第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，39(13)1355

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