【摘要】：細(xì)菌性痢疾(簡(jiǎn)稱(chēng)菌痢)是以志賀菌侵襲結(jié)腸粘膜,上皮細(xì)胞炎癥滲出為特征的腸道急性傳染病,其在世界各地都有流行,是全球重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。氨芐西林作為廣譜抗生素,在禽畜養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用于治療腸桿菌科細(xì)菌感染。由于氨芐西林持續(xù)廣泛使用及濫用,導(dǎo)致志賀菌屬細(xì)菌對(duì)其耐藥性增強(qiáng),在“One Health”(同一健康)的理論下,耐藥菌會(huì)傳播到人類(lèi),嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康安全。目前對(duì)于治療細(xì)菌性痢疾失敗的原因主要?dú)w因于耐藥。然而志賀菌對(duì)抗生素耐受同樣也會(huì)導(dǎo)致抗生素治療感染性疾病的失敗。關(guān)于志賀菌對(duì)氨芐西林耐受的基因水平機(jī)制的研究尚不明確,本文將通過(guò)體外誘導(dǎo)的方法獲得耐受株,運(yùn)用全基因組測(cè)序的方法分析志賀菌株對(duì)氨芐西林耐受的相關(guān)機(jī)制,為控制志賀菌對(duì)抗生素耐藥提供理論基礎(chǔ)。目的通過(guò)體外誘導(dǎo)的方法獲得志賀菌對(duì)氨芐西林的耐受株,探討志賀菌對(duì)氨芐西林耐受形成的特點(diǎn)及分子機(jī)制。方法1.對(duì)2014年分離于河南省睢縣腹瀉患者糞便樣本中的細(xì)菌進(jìn)行生化和血清學(xué)鑒定,運(yùn)用K-B紙片擴(kuò)散法篩選對(duì)氨芐西林敏感的菌株。2.采用微量肉湯稀釋法測(cè)定對(duì)氨芐西林敏感株的最低抑菌濃度(MIC),用10MIC氨芐西林抗生素濃度間隔誘導(dǎo)志賀菌,測(cè)定其耐受評(píng)價(jià)指標(biāo)MDK99。3.原代志賀菌株mel-ss2014011以及誘導(dǎo)菌株mel-ss2014011-10做全基因組測(cè)序,對(duì)誘導(dǎo)菌株mel-ss2014011-20做重測(cè)序,篩選與耐受相關(guān)的基因以及non-SNPs以及Indels。4.RT-PCR檢測(cè)發(fā)生non-SNPs的相關(guān)基因的表達(dá)水平。結(jié)果1.經(jīng)過(guò)生化及血清學(xué)鑒定分離出1株對(duì)氨芐西林敏感宋內(nèi)志賀菌,命名為:mel-ss2014011。2.原代志賀菌株對(duì)氨芐西林的MIC為2μg/ml,經(jīng)氨芐西林間隔誘導(dǎo)后,誘導(dǎo)菌株mel-ss2014011-10及mel-ss2014011-20的MIC保持不變,仍然為2μg/ml,而原代菌株的細(xì)菌濃度從6.5×1010 CFU/ml降低為2.9×108 CFU/ml的時(shí)間為10 min(即:MDK99為10 min),誘導(dǎo)菌株mel-ss2014011-10的細(xì)菌濃度從6.5×1010 CFU/ml降低為1.85×108 CFU/ml的時(shí)間為40 min(即:MDK99為40 min)。說(shuō)明菌株已經(jīng)耐受,而mel-ss2014011-20株的細(xì)菌濃度的從2.8×109 CFU/ml降至5×107 CFU/ml的時(shí)間超過(guò)10h(即:MDK99超過(guò)10h)。3.全基因組測(cè)序結(jié)果顯示,原代株mel-ss2014011特有基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)有對(duì)應(yīng)的基因名稱(chēng)共29個(gè),這些基因在COG功能數(shù)據(jù)庫(kù)中除了GL000514基因的功能未知外,其余基因的功能主要集中在能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換,翻譯,核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生,細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸,分泌和囊泡運(yùn)輸,碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝,以及防御機(jī)制。mel-ss2014011-10特有基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)有對(duì)應(yīng)的基因名稱(chēng)共4個(gè),除了11-10GL002198基因的功能在COG功能數(shù)據(jù)庫(kù)未知外,其余基因的功能主要集中在翻譯,核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生。重測(cè)序結(jié)果表明,與mel-ss2014011相比,mel-ss2014011-10無(wú)SNP結(jié)果,而mel-ss2014011-20具有1個(gè)非同義突變。在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)GL002314基因名的注釋是cfa,編碼環(huán)丙烷脂肪�；字铣擅�。與mel-ss2014011相比,mel-ss2014011-10有5個(gè)插入,1個(gè)缺失,其中位于編碼區(qū)的有2個(gè),與mel-ss2014011相比,mel-ss2014011-20有39個(gè)插入,1個(gè)缺失,其中位于編碼區(qū)的有23個(gè),而與mel-ss2014011比,mel-ss2014011-10以及melss2014011-20共有Indel為1個(gè),即:GL004657基因,該基因編碼的產(chǎn)物為轉(zhuǎn)座酶,在COG中的分類(lèi)為X,該基因在ARDB耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)解釋,此轉(zhuǎn)座酶并無(wú)攜帶有耐藥基因。4.RT-PCR結(jié)果顯示,mel-ss2014011,mel-ss2014011-10,mel-ss2014011-20中cfa基因的相對(duì)表達(dá)水平分別為1±0.14,2.81±0.24,7.56±0.90。方差分析顯示野生型和誘導(dǎo)菌株的表達(dá)差異顯著(F=118.87,P0.001)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,LSD-t檢驗(yàn)結(jié)果顯示兩兩之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論1.在氨芐西林的間隔誘導(dǎo)下,志賀菌可以發(fā)生耐受。在氨芐西林誘導(dǎo)志賀菌的20個(gè)循環(huán)內(nèi),循環(huán)數(shù)越大,其MDK99值越大。2.與原代株相比,誘導(dǎo)株mel-ss2014011-10比原代株少了29個(gè)基因,多了4個(gè)基因,這些基因的功能主要集中在能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換,翻譯,核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生,細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸,分泌和囊泡運(yùn)輸,碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝,以及防御機(jī)制。它們可能與志賀菌耐受相關(guān)。3.志賀菌對(duì)氨芐西林耐受可能與cfa基因有關(guān),其表達(dá)量的升高,促使細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐受。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R446.5
【圖文】：

頭孢西丁 FOX 30≤14 15-17 ≥18頭孢哌酮 CFP 32≤15 16-20 ≥21頭孢噻肟 CTX34≤22 23-25≥26頭孢他叮 CAZ 32 ≤17 18-20 ≥21頭孢唑林 CZO 28 ≤19 20-22 ≥23氨曲南 AZT 32 ≤17 18-20 ≥21環(huán)丙沙星 CIP 24 ≤15 16-20 ≥21四環(huán)素 TCY 24 ≤11 12-14 ≥15頭孢呋辛 CXM 25 ≤14 15-17 ≥18左氧氟沙星 LVX 20 ≤13 14-16 ≥17妥布霉素 TOB 15 ≤12 13-14 ≥15亞胺培南 IMP 30 ≤19 20-22 ≥23氨芐西林 AMP 24 ≤13 14-16 ≥17頭孢曲松 CRO 35 ≤19 20-22 ≥23美羅培南 MEM 35 ≤19 20-22 ≥23阿莫西林/棒酸 AMC 24 ≤13 14-17 ≥18

U/ml 降至 0，而 mel-ss2014011-20 株的細(xì)菌濃度從 2.8×109CFU/ml 降至 5×107CFU/ml 超過(guò) 10h（即：MDK99超過(guò) 10 h）（圖3.2）。無(wú)抗對(duì)照菌株與原代株的 MIC 和 MDK99一致，表明在抗生素壓力下會(huì)產(chǎn)生志賀菌耐受性（圖 3.1 和圖 3.2）。

圖 3.3 mel-ss2014011 的堿基和質(zhì)量分布圖注：（A）圖為堿基分布圖，（B）圖為質(zhì)量分布圖圖 3.4 mel-ss2014011-10 的堿基和質(zhì)量分布圖注：（A）圖為堿基分布圖，（B）圖為質(zhì)量分布圖

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本文編號(hào)：2786897