【摘要】：目的:自RNA化學(xué)修飾發(fā)現(xiàn)以來,研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了超過150種RNA修飾。其中N~6-甲基腺苷(N~6-methyladenosine,m~6A),被證實(shí)是真核生物中含量最豐富的RNA化學(xué)修飾之一。生物體內(nèi)不同水平的m~6A發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能,而這些生物學(xué)功能的異常則是導(dǎo)致腫瘤和疾病的重要因素。由于m~6A不會(huì)改變其與T和U的堿基互補(bǔ)配對(duì)能力,因此不能用標(biāo)準(zhǔn)雜交或測(cè)序技術(shù)直接檢測(cè)m~6A;此外,目前缺乏能有效區(qū)分m~6A和A的化學(xué)方法,且RNA不穩(wěn)定化學(xué)處理過程中降解增多,導(dǎo)致m~6A檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展進(jìn)一步受限;致使m~6A的確切生物學(xué)調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展緩慢。因此,建立一種m~6A快速、準(zhǔn)確檢測(cè)方法對(duì)m~6A的研究有著重要意義。方法:本研究以抗m~6A抗體,既能識(shí)別RNA中的m~6A也能識(shí)別DNA中的m~6A為基礎(chǔ),建立了一種無標(biāo)記且高特異的電化學(xué)免疫傳感方法,用于RNA中m~6A的檢測(cè)。首先,利用組氨酸標(biāo)記的重組蛋白G(his-PG)將抗m~6A抗體定向固定于金電極表面,以提高抗原抗體結(jié)合效率;其次,以合成的類修飾DNA探針(L1)作為信號(hào)分子與m~6A-RNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗m~6A抗體,以拓寬新方法的檢測(cè)范圍;然后,用核糖核酸酶(RNase A)水解與抗體結(jié)合的m~6A-RNA,以消除m~6A-RNA長度及堿基序列對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成的影響,提高準(zhǔn)確度。最后,通過檢測(cè)免疫傳感器的電阻抗譜(EIS)信號(hào),實(shí)現(xiàn)對(duì)RNA中m~6A的檢測(cè)。結(jié)果:在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下,所構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器具有較高的靈敏度和特異性。由于競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制的存在,該方法的線性范圍較非競(jìng)爭(zhēng)法有大幅增加,為0.05~200 nM;檢測(cè)限低至0.016 nM(S/N=3)。此外,該免疫傳感器成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)HepG2、L02、HBE和A549細(xì)胞系總RNA中m~6A的檢測(cè)。結(jié)論:本研究通過his-PG將抗m~6A抗體定向固定于金電極表面,不僅提高抗原抗體結(jié)合效率,而且也保證了每個(gè)抗體都能被抗原所飽和,提高方法的重復(fù)性。利用類修飾DNA探針作為信號(hào)分子與m~6A-RNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗m~6A抗體以擴(kuò)大線性范圍。同時(shí)利用RNase A的水解作用,消除了不同長度RNA和堿基序列對(duì)檢測(cè)造成的干擾。在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下,實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同細(xì)胞系來源的總RNA中m~6A的檢測(cè),證明所構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器,具備準(zhǔn)確檢測(cè)生物樣本來源的RNA中m~6A含量的潛力。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R446.6;TP212
【圖文】：

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文his-PG 的組氨酸標(biāo)簽與金電極表面牢固結(jié)合，形成 PG 的定向?qū)�。PG 識(shí)別抗體的可結(jié)晶片段區(qū)域（Fc），促使抗體定向固定于金電極表面，從而將抗體的結(jié)合位點(diǎn)暴露于環(huán)境中，更有利于抗原抗體的結(jié)合[44]。其次，利用L1與樣品中的m6A-RNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗體。然后，引入RNase A水解掉與抗體結(jié)合的m6A-RNA，將 m6A-RNA的檢測(cè)轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì) m6A-DNA 的檢測(cè)，通過檢測(cè)電化學(xué)免疫傳感器的 EIS 信號(hào)，實(shí)現(xiàn)樣品中 m6A-RNA 的檢測(cè)。在該體系中，競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)將大大拓寬免疫傳感器的檢測(cè)范圍[45]，而 RNase A 的采用將消除由于 m6A-RNA 長度和堿基序列的不同對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成的干擾，提高檢測(cè)準(zhǔn)確度。

大小與 RNA 樣本中 m6A 的含量成反比。2 結(jié)果與討論2.1 電極表征2.1.1 原子力顯微鏡表征原子力顯微鏡（AFM）是分辨電極表面形貌變化的一種直觀有效的方法。圖1A 展示的是金電極表面固定了 his-PG 后的形貌圖。當(dāng)抗-m6A -抗體與 his-PG 結(jié)合后，電極表面出現(xiàn)了許多類似駝峰狀的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的形狀與 IgG 類抗體的“Y”字形一致，說明 his-PG 能夠?qū)⒖?m6A 抗體固定在金電極表面（圖 1B）。同時(shí)，所有的抗體都是朝上均勻一致的排列，提示 his-PG 能夠?qū)贵w進(jìn)行定向固定。然后，在電極表面加上 m6A-DNA（L1）后，形貌圖中出現(xiàn)了許多絲帶狀的結(jié)構(gòu)（圖 1C），這與單鏈 DNA 的結(jié)構(gòu)形態(tài)相符，證明抗 m6A 抗體能夠特異性捕獲 m6A。因此

針 L1（圖 2A-f）后，帶負(fù)電的探針和[Fe(CN)6]之間的靜電排斥，使電流信號(hào)繼續(xù)降低。最后，用 RNase A 水解掉電極上的探針 P1，由于靜電斥力的消失，電流信號(hào)相比于曲線 e 回升（曲線 g）。以上結(jié)果，證實(shí)該電化學(xué)免疫傳感器的制備是可行的。

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本文編號(hào)：2784090