【摘要】：細(xì)胞是生命結(jié)構(gòu)和功能的基本單位,結(jié)構(gòu)和功能多樣化的細(xì)胞相互作用,共同構(gòu)成復(fù)雜的生命體。生命體中的細(xì)胞由于功能的多樣化,細(xì)胞間具有明顯的異質(zhì)性。這種差異往往在生命有機(jī)體的生長(zhǎng)、分化和發(fā)育等過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。同樣,在癌癥的發(fā)展過(guò)程中,不同類型或者不同狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞由于其所處的生理環(huán)境的差異性及腫瘤的發(fā)展過(guò)程的差異性,腫瘤細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)及生命活性物質(zhì)都有很大的差異性。而miRNA作為重要的生物活性分子,廣泛參與到生命活動(dòng)的進(jìn)程中去。尤其在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中,與腫瘤發(fā)展相關(guān)的miRNA的含量會(huì)發(fā)生的相應(yīng)的含量變化。在已有的研究成果中顯示,可以通過(guò)miRNAs的含量的分布情況進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的分類和鑒定。如果能在疾病發(fā)生之初及時(shí)的檢測(cè)并施以正確的治療方案,可以達(dá)到早期診斷、防病于未然之中,具有非常重要的臨床應(yīng)用前景。然而,對(duì)于腫瘤的早期診斷來(lái)講,能夠在癌癥早期進(jìn)行相應(yīng)的診斷方案非常少。循環(huán)腫瘤細(xì)胞是進(jìn)行癌癥早期評(píng)價(jià)的重要指標(biāo),但是血液中含量極低,很難進(jìn)行基于傳統(tǒng)手段群體細(xì)胞的檢測(cè)和分析。單細(xì)胞分析是非常適用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)和分析的手段。由于單細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)miRNAs的含量極低,傳統(tǒng)的方案由于各種局限性很難實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞內(nèi)miRNAs的高靈敏檢測(cè)�；诖�,我們提出了一種基于微流控液滴的單細(xì)胞內(nèi)miRNAs的高通量和高靈敏的檢測(cè)方案,并利用該方案實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞內(nèi)多種miRNAs的同時(shí)檢測(cè),并將該方法應(yīng)用到腫瘤細(xì)胞的分類中去。本論文共三個(gè)部分,其中:第一章為緒論,首先介紹了單細(xì)胞分析在生命科學(xué)中的重要性,以及目前對(duì)于單細(xì)胞檢測(cè)已有的主要的檢測(cè)類型進(jìn)行簡(jiǎn)單的概述;然后對(duì)miRNAs在生命科學(xué)中的功能和應(yīng)用以及目前已有的單細(xì)胞內(nèi)miRNAs的分析策略和方法進(jìn)行了闡述。第二章為用于單細(xì)胞miRNA定量檢測(cè)的微液滴系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建。在該章中我們通過(guò)設(shè)計(jì)高通量的液滴生成芯片進(jìn)行了高通量的穩(wěn)定的液滴生成,并通過(guò)優(yōu)化構(gòu)建的微液滴系統(tǒng)進(jìn)行高通量的單細(xì)胞操控,為單細(xì)胞的高通量檢測(cè)提供了基礎(chǔ)和依據(jù)。第三章為基于微流控液滴的單細(xì)胞內(nèi)多種mi RNAs的定量檢測(cè)及其用于腫瘤細(xì)胞的分類。我們發(fā)展了一種基于微流控液滴進(jìn)行單細(xì)胞的高通量包裹,在液滴內(nèi)進(jìn)行miRNAs的二次等溫信號(hào)擴(kuò)增并用實(shí)驗(yàn)室自行搭建的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)裝置進(jìn)行液滴內(nèi)熒光信號(hào)檢測(cè)的方案。利用該分析方案進(jìn)行了單細(xì)胞內(nèi)miRNAs的高通量定量檢測(cè)。通過(guò)對(duì)不同種類的細(xì)胞之間的miRNAs的含量進(jìn)行測(cè)量并繪制其分布圖譜,實(shí)現(xiàn)了不同種類癌癥細(xì)胞基于miRNAs表達(dá)含量的不同進(jìn)行分類。為單細(xì)胞內(nèi)miRNAs的高通分析及細(xì)胞類型的分類提供了一種新的方法。
【學(xué)位授予單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R440
【圖文】：

圖 1-1 單細(xì)胞分析中常見(jiàn)的分析手段[7]。A）毛細(xì)管電泳—激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)方案實(shí)現(xiàn)待測(cè)組分的分離并研究單細(xì)胞的胞吐；b) 利用基于光纖維的納米生物傳感器進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞外乳酸的熒光檢測(cè)；c) 利用電分析法研究受刺激后的單個(gè)細(xì)胞的胞吐；d) 基于質(zhì)譜的方法進(jìn)行單細(xì)胞的代謝組分分析。1.2.1 基于分離的單細(xì)胞分析基于分離的單細(xì)胞分析技術(shù)在單細(xì)胞的發(fā)展過(guò)程中起到非常重要的作用，已經(jīng)被用來(lái)進(jìn)行單細(xì)胞胞吐的研究。但是僅僅依靠傳統(tǒng)的分離技術(shù)很難實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞胞吐的研究。由于單細(xì)胞的體積小，大約在皮升數(shù)量級(jí)[8，9]。那么在進(jìn)行單細(xì)胞分析時(shí)，需要高效、低樣品消耗量且靈敏度高的檢測(cè)手段，才能解決檢測(cè)單細(xì)胞體積小、待測(cè)組分含量低的問(wèn)題。在此，毛細(xì)管電泳相比于傳統(tǒng)的分離局勢(shì)（液相色譜、氣相色譜等）具有更好的質(zhì)量靈敏度[10，11]。毛細(xì)管電泳依靠帶電分子在

圖 1-2 微流控芯片的詳細(xì)部分的通道布局和圖像[19]，用于監(jiān)測(cè) 15 個(gè)獨(dú)立胰島細(xì)胞的胰島素分泌。(A)整個(gè)設(shè)備的通道網(wǎng)絡(luò)。微流體通道由實(shí)心黑線表示，圓形代表流體儲(chǔ)存室。每一種類型的流體儲(chǔ)存室(持有不同的溶液)都用不同的顏色來(lái)表示清楚。(B)一個(gè)胰島細(xì)胞灌注室的側(cè)視圖表示(不按比例)。胰島被加載到帶有生理緩沖的胰島室，然后在立體顯微鏡下用 PDMS 塞密封。灌注緩沖液流過(guò)整個(gè)胰島室，并將所有分泌的胰島素推入取樣通道。(C)剪切流分離的 CCD 成像，允許快速流動(dòng)的胰島素樣流與驅(qū)動(dòng)型免疫測(cè)定試劑的慢流兼容。箭頭表示流向和估計(jì)的流量大小。(D) CCD 相機(jī)拍攝區(qū)域的明場(chǎng)圖像。從 15 個(gè)分離通道流出，進(jìn)入芯片的中心部分，然后通過(guò)一個(gè)單一的廢液通道流出(照片的底部中心)。本系統(tǒng)應(yīng)用于 AtT-20 細(xì)胞的神經(jīng)節(jié)苷脂代謝分析。細(xì)胞與熒光染料四甲基羅丹明(TMR)-GM1 孵育，并產(chǎn)生了一系列具有熒光標(biāo)記的代謝物。使用毛細(xì)管電泳分離組分和激光誘導(dǎo)熒光裝置進(jìn)行檢測(cè)，他們能夠在單細(xì)胞水平進(jìn)行代謝分析。

液滴的單細(xì)胞內(nèi)多種 miRNAs 的定量檢測(cè)及其用于相關(guān)疾病細(xì)胞含量稀少的待測(cè)物來(lái)說(shuō)具有減少擴(kuò)散。可以保護(hù)單細(xì)胞內(nèi)待測(cè)的活性物質(zhì)的活性，單細(xì)胞的隔離，在單細(xì)胞的分析上具有明顯的展了一種微液滴內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增方法用于單細(xì)胞被破膜后，胞內(nèi)的 miRNA 可誘發(fā)兩條物 DNA 作為 PCR 模板被單分子封裝在兩萬(wàn)過(guò)計(jì)數(shù)發(fā)出熒光的液滴數(shù)目可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞內(nèi)目分析是一種在循環(huán)腫瘤細(xì)胞分析中常用到的的含量極少，可利用微流控芯片從樣品中高效，后續(xù)對(duì)其進(jìn)行基因分析。

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本文編號(hào)：2780576