【摘要】：腦膠質(zhì)瘤(GBM)在所有腫瘤疾病中,是最為強侵襲性、難治療的腫瘤之一,而膠質(zhì)瘤干細胞(GSC)是導(dǎo)致GBM發(fā)展以及后續(xù)復(fù)發(fā)的基本因素,因此針對腫瘤干細胞的治療是徹底根治腫瘤的過程。近年來,隨著再生醫(yī)學(xué)、組織工程、基因治療等技術(shù)的快速發(fā)展,采用基因工程的方法作為一種抑制膠質(zhì)瘤的治療手段,其作用越來越突出。其中,病毒載體方法是應(yīng)用最廣的基因傳遞方法,但仍然存在一定的局限性。人們把目光更多地轉(zhuǎn)向了非病毒載體系統(tǒng)和聯(lián)合基因治療。利用物美價廉的原料制備高效的非病毒納米載體是基因治療研究的熱點之一。本課題著重制備了新型非病毒納米載體——碳量子點(Carbon quantum dots,CDs),并以此為載體進行U251干細胞的神經(jīng)分化研究,以及相關(guān)的誘導(dǎo)分化以及體內(nèi)驗證和機理研究,為GBM的基礎(chǔ)研究以及臨床治療提供新方法、新思路。第一章綜述基于GBM的世界性難題、干細胞學(xué)說的提出、基因療法的優(yōu)勢以及在基因載體的多樣化基礎(chǔ),本章內(nèi)容分兩大部分即GBM的研究進展和CDs的研究進展,分別進行總結(jié)與概述。介紹了GBM的疾病現(xiàn)狀、研究方向以及治療手段,包括各自方法的優(yōu)缺點以及在理論研究、臨床研究、臨床中的治療應(yīng)用現(xiàn)狀;著重介紹CDs作為新型納米基因載體,主要包括其發(fā)展、制備方法、在基因傳遞中的廣泛應(yīng)用以及展望,對本課題的提出奠定堅實的理論基礎(chǔ)。第二章CDs的制備與表征本章制備并優(yōu)化CDs的處方工藝,具體包括:以殼聚糖季銨鹽和無水乙二胺(EDA)為原材料,在預(yù)實驗基礎(chǔ)上通過一系列實驗設(shè)計,制備16種CDs樣品;在此基礎(chǔ)上,考察了兩種除菌方法即過濾除菌和加熱除菌,以熒光強度、DNA凝膠電泳、CDs攜帶EGFP質(zhì)粒能力為指標,考察各個處方得到最佳量子點樣品為第七組樣品:即后反應(yīng)溫度為160℃,EDA用PBS稀釋5倍,所占體系總體積比為20%,除菌法為過濾除菌法;基因與CDs的最佳基因轉(zhuǎn)染比為1:10,以后將此樣品作為后續(xù)轉(zhuǎn)染、誘導(dǎo)的基礎(chǔ),進行一系列相應(yīng)研究。進一步對最佳量子點樣品進行TEM、粒徑電位、IR、細胞毒性等表征。經(jīng)實驗結(jié)果得知,CDs對細胞的毒性較小,幾乎無毒,具明亮綠色熒光,可作為非病毒載體應(yīng)用于組織工程研究。第三章CDs介導(dǎo)的U251干細胞體外誘導(dǎo)分化研究本章主要從以下三個方面進行開展,首先對U251細胞進行干細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基(ES培養(yǎng)基)培養(yǎng),通過流式細胞儀篩選CD133~+的U251細胞,得到U251干細胞作為后續(xù)實驗的種子細胞。經(jīng)八種入胞抑制劑的入胞機制篩選,說明CDs納米基因傳遞系統(tǒng)通過網(wǎng)格蛋白、穴陷小泡介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞作用實現(xiàn)入胞。其次,以Wnt3a、Brn2、Ascl-1三種轉(zhuǎn)錄因子自由組合,進行最佳因子組合篩選,從免疫熒光(immunofluorescence,IF)結(jié)果得出,Wnt3a、Brn2因子組合在最短時間內(nèi)可實現(xiàn)U251干細胞向神經(jīng)細胞分化,因此將其組合作為最佳基因組合做進一步研究。后續(xù)U251干細胞經(jīng)CDs載最佳基因組合進行轉(zhuǎn)染誘導(dǎo),經(jīng)四次轉(zhuǎn)染后,細胞首先從形態(tài)上呈現(xiàn)類似于神經(jīng)細胞的結(jié)構(gòu)形態(tài),之后由IF、酶聯(lián)免疫分析(ELISA)、反轉(zhuǎn)錄-PCR(QT-qPCR)和蛋白印跡(Western blotting,WB)實驗從定性定量角度證明,干性標記物蛋白CD133表達呈現(xiàn)明顯下調(diào)的跡象;GFAP作為膠質(zhì)細胞的特性隨轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)的時間延長表達下調(diào),神經(jīng)細胞相關(guān)蛋白(NeuN,β-Tubulin III(Tuj1))隨轉(zhuǎn)染時間的延長呈現(xiàn)逐漸上調(diào),探討了神經(jīng)分化效能;另外也考察了基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平,實驗結(jié)果表明CDs成功將基因Wnt3a和Brn2轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)進行生物轉(zhuǎn)錄與翻譯,并且有向神經(jīng)細胞分化的可行性,在GBM的基礎(chǔ)理論研究方面提供了又一新思路。第四章CDs介導(dǎo)的U251干細胞體內(nèi)誘導(dǎo)分化研究本章主要研究U251干細胞以及誘導(dǎo)后的U251干細胞在裸鼠體內(nèi)原位移植后的分化情況。從裸鼠生存狀態(tài)、體重變化、成瘤性、組織切片HE染色、免疫組化等方面評價體內(nèi)神經(jīng)誘導(dǎo)效能,并通過基因芯片對分化機理進行初步研究。結(jié)果表明實驗組裸鼠生存狀態(tài)相對良好,體重相對穩(wěn)定,HE和免疫組化染色表明,實驗組異型性相對對照組不是很明顯,腫瘤細胞轉(zhuǎn)而呈向神經(jīng)細胞分化的趨勢。通過對基因芯片數(shù)據(jù)分析得知,p53等癌基因相關(guān)通路的相關(guān)蛋白呈下調(diào)趨勢。研究結(jié)果與體外研究數(shù)據(jù)相一致,可為膠質(zhì)疾病提供可靠的臨床前研究數(shù)據(jù)與依據(jù)。第五章Wnt、Notch通路研究本章通過Wnt通路和Notch通路相關(guān)因子的表達情況,研究轉(zhuǎn)錄因子與兩個通路之間的關(guān)系。首先進行QT-qPCR檢測,考察Notch信號通路關(guān)鍵基因Notch1和HES-1的表達強弱,發(fā)現(xiàn)通路蛋白的降低與U251干細胞的分化密切相關(guān)。其次,采用免疫組化法檢測Wnt通路中相關(guān)蛋白的表達水平可知,U251干細胞經(jīng)CDs的載神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子的誘導(dǎo)分化實現(xiàn)向神經(jīng)細胞分化,同樣證明在U251干細胞的誘導(dǎo)分化方面,Wnt通路具有重要作用。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R450;R739.4
【圖文】：

圖 2.1 不同組 CDs 熒光顏色圖(A、B、C、D 分別代表后反應(yīng)溫度為 160 °C、170 °C、180 °C、190 °C，1、2、3、4、5 分別代表后反應(yīng)時間為 2 h、3 h、4 h、5 h、對照組：UP水)FIG. 2.1 fluorescence color of CDs in different groups（A, B, C, D respectively representafter reaction temperature of 160 °C, 170 °C, 180 °C, 190 °C, 1, 2, 3, 4, 5 respectivelyrepresent after the reaction time of 2 h, 3 h, 4 h, 5 h, control ：UPwater）如圖 2.1，經(jīng)手提式紫外分析儀于 365 nm 波長下照射可見，16 種 CDs 樣品呈現(xiàn)不同程度的綠色熒光。其中，D3 因為碳化無熒光，D4 略有碳化現(xiàn)象；剩余的 D 組和 C 組樣品呈現(xiàn)的綠色熒光強于 A、B 組的，B 組 4 種樣品熒光無明顯差異，A 組中 A2、A4 強于 A3、A5，但是在視野下依舊是很強烈的綠色熒光。而對照組雙蒸水溶液呈現(xiàn)無色透明，經(jīng)多次驗證，制備的 CDs 樣品較成功，顏色均一且深。

圖 2.3 CDs 樣品轉(zhuǎn)染 EGFP 基因的蛋白表達圖（圖片為最佳 CDs 樣品的 EGFP 蛋白表達圖，其余樣品均無表達，B 為 A 的局部放大圖）Figure 2.3 protein expression of CDs-transfected EGFPPlasmid The protein expressionpicture of EGFPgene transfected by CDs samples (these figures are the EGFPproteinexpression of the best CDs sample, while other samples are not expressed.B is partialenlarged view ofA)在得到的上述各樣品的最低基因滯留比的基礎(chǔ)上進行優(yōu)化，考察最佳基因轉(zhuǎn)染比，以此得到最佳轉(zhuǎn)染的 CDs 樣品。即先進行樣品最低滯留比的上下二倍關(guān)系的滯留比設(shè)置（如對于可得 160°C 反應(yīng) 2h 的最低滯留比為 1：15，因此可設(shè)置最佳基因轉(zhuǎn)染比為 1：7.5，1：15，1：30，其他比例以此類比）。之后進行 CDs載基因轉(zhuǎn)染，48h 后觀察到有且只有一組比例樣品有蛋白表達，即有 EGFP 的綠色熒光，其余均無熒光出現(xiàn)，由此得到最佳 CDs 樣品和最佳基因轉(zhuǎn)染比。其中，

圖 2.4 CDs 的電位測定圖Figure 2.4 Zeta potential chart of CDs對最佳 CDs 樣品進行電位測定，測得 CDs 的電位呈現(xiàn)電正性，數(shù)值為㧏17.88mV，質(zhì)粒因帶負電荷與 CDs 結(jié)合后，電位值有所下降，但整體依舊帶正電荷為㧏7.98mV。因此帶正電荷的 CDs 與帶負電荷的基因在靜置時由于靜電吸附作用可自組裝成納米粒，為 CDs 載基因進人細胞提供條件。2.3.5 粒徑考察

【參考文獻】

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本文編號：2776996