【摘要】：目的:觀察iMSC-Exo對LPS誘導(dǎo)AM炎癥反應(yīng)的抑炎作用,初步探討iMSC-Exo發(fā)揮抑炎作用的分子機(jī)制。方法:體外培養(yǎng)iMSC,采用旋轉(zhuǎn)超濾法提取細(xì)胞上清液中的iMSC-Exo,并利用透射電子顯微鏡(TEM)、高分辨率可調(diào)電阻脈沖(TRPS)、蛋白免疫印跡技術(shù)對其進(jìn)行鑒定;體外培養(yǎng)AM,分別予PBS、iMSC-Exo、LPS、LPS+iMSC-Exo處理;通過第二代高通量測序技術(shù)比較LPS組和LPS+iMSC-Exo組間的差異miRNAs表達(dá)譜;將miR-125b-5p mimic或inhibitor轉(zhuǎn)染至LPS+iMSC-Exo誘導(dǎo)的AM中;采用ELISA檢測各組AM上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量,采用qRT-PCR技術(shù)檢測各組AM中TNF-α、IL-1β、IL-6并驗證miR-125b-5p在AM中及iMSC-Exo內(nèi)的表達(dá)情況;Western Blot技術(shù)檢測各組AM中TRAF-6、NF-κB(p65)、p-p65的蛋白表達(dá)情況;采用免疫熒光觀察iMSC-Exo與AM中的共定位情況及細(xì)胞中TRAF-6的熒光表達(dá)。結(jié)果:(1)透射電鏡下觀察提取的iMSC-Exo為圓形或橢圓形的膜性小囊泡,粒子直徑大約為40-100nm,且表達(dá)外泌體蛋白標(biāo)志物CD9及CD63。(2)將iMSC-Exo與LPS預(yù)刺激的AM共培養(yǎng)24h后,上清液和細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白及mRNA含量較LPS組相比均明顯降低;熒光顯微鏡下可見熒光標(biāo)記的iMSC-Exo包繞在AM細(xì)胞核周圍,提示iMSC-Exo能夠被AM吞噬。(3)第二代高通量測序結(jié)果顯示:以LPS+iMSC-Exo組與LPS組表達(dá)比值≥2倍作為差異表達(dá)的miRNAs,LPS+iMSC-Exos分別刺激AM 6h和24h后,上調(diào)2倍以上的miRNAs分別有90個和30個,其中包括miR-125b-5p、miR-9b-3p、miR-135a-5p等12個miRNAs表達(dá)水平于兩時間點均發(fā)生顯著上調(diào),篩選出與炎癥反應(yīng)相關(guān)的miRNAs在體外進(jìn)行驗證,發(fā)現(xiàn)miR-125b-5p上調(diào)最明顯,且miR-125b-5p在iPSC-MSC-Exo中也為高表達(dá)水平。(4)通過對LPS+iMSC-Exo誘導(dǎo)的AM轉(zhuǎn)染miR-125b-5p mimic過表達(dá)miR-125b-5p,能夠顯著增強(qiáng)iMSC-Exo對LPS誘導(dǎo)AM炎癥反應(yīng)的抑炎作用;而通過轉(zhuǎn)染miR-125b-5p inhibitor沉默miR-125b-5p,則能夠削弱iMSC-Exo對LPS誘導(dǎo)AM炎癥反應(yīng)的抑炎作用。(5)生物信息學(xué)分析預(yù)測提示TRAF-6基因的3’-UTR與miR-125b-5p的種子區(qū)存在互補(bǔ)配對序列;雙熒光素酶報告基因驗證發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-125b-5p可使野生型TRAF6-3’UTR載體的熒光素酶活性降低約30%,而對突變型TRAF6-3’UTR載體的熒光素酶活性無明顯影響。(6)將iMSC-Exo與LPS預(yù)刺激的AM共培養(yǎng)24h后,AM中的TRAF-6、P-P65蛋白表達(dá)水平較LPS組均顯著下降,而NF-κB的蛋白水平無明顯變化。(7)對LPS+iMSC-Exo誘導(dǎo)的AM轉(zhuǎn)染miR-125b-5p mimic過表達(dá)miR-125b-5p,TRAF-6及P-P65蛋白表達(dá)水平較陰性對照組均下降;而轉(zhuǎn)染miR-125b-5p inhibitor沉默miR-125b-5p,使得AM中TRAF6蛋白表達(dá)上調(diào),NF-κB核移位增加。結(jié)論:iMSC-Exo通過miR-125b-5p靶向TRAF-6,抑制AM中NF-κB炎癥信號通路的激活,減輕LPS誘導(dǎo)的AM炎癥反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R459.7
【圖文】：

1iMSC-Exo的鑒定

第 3 章 結(jié)果誘導(dǎo) AM 炎癥反應(yīng)模型建立成功；與 LPS 組相比，LPS+iMSC-Exo 組 AM 炎癥因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α含量均明顯降低（分別為 120.33±16.21 pg/ml vs202.33±11.47 pg/ml、139.67±11.95 pg/ml vs 256.33±24.90 pg/ml、290.33±26.67pg/ml vs 440.00±28.61 pg/ml，P＜0.05），提示iMSC-Exo能夠減輕LPS誘導(dǎo)的 AM炎癥反應(yīng)，見圖 3.1.2A。采用 qRT-PCR 技術(shù)檢測各組 AM 中炎癥因子 IL-1β 、IL-6、TNF-α的 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與 LPS 組相比，LPS+iMSC-Exos 組 AM 炎癥因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α mRNA 表達(dá)水平均明顯降低（分別為 1.66±0.10 vs 3.00±0.18、1.69±0.15 vs 2.67±0.18、2.49±0.35 vs 4.42±0.10，P＜0.05），見圖 3.1.2 B。

3iMSC-Exo被AM攝取

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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2 胡國文;李青;牛鑫;胡斌;劉鵑;沈曉黎;汪泱;鄧志鋒;;旋轉(zhuǎn)超濾:一種提取細(xì)胞外泌體的新方法[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2014年06期

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本文編號：2775420