【摘要】：目的:本研究擬整合等溫DNA擴增技術(shù)和微流控芯片技術(shù)的特色與優(yōu)勢,建立一種適合于基層及欠發(fā)達地區(qū)醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)的HPV分型方法,為HPV篩查及進一步研究HPV病毒載量與宮頸病變的關(guān)系提供新的工具。方法:1.雙熒光等溫多自配引發(fā)擴增(IMSA)法檢測HPV16、52型。1)針對HPV16E7和HPV52E6基因序列各設(shè)計6條特異性引物,在等溫條件下(63℃)進行擴增反應(yīng)60 min,在擴增前加入染料羥基萘酚藍(HNB)和SYBR GreenⅠ的混合染料作為反應(yīng)指示劑,以反應(yīng)最終熒光顏色變化作為結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)。2)利用該方法對系列稀釋的HPV16和HPV52質(zhì)粒進行靈敏度分析。3)用已知單重感染HPV6、16、18、39、52、58、59的臨床標(biāo)本進行特異性分析。4)用已建立的等溫多自配引發(fā)擴增(IMSA)技術(shù)與103例宮頸刮片臨床標(biāo)本進行比對驗證。2.一種可用于HPV16型精確定量的數(shù)字LAMP微流控芯片。1)在PCR管中對HPV16進行雙熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)反應(yīng),并分析其靈敏度和特異性。2)應(yīng)用多層軟光刻技術(shù),以聚二甲基硅氧烷(PDMS)作為芯片材料,制作了一種新型的可用于核酸精確定量的數(shù)字等溫微流控芯片(60 mm′40 mm′4 mm)。3)建立適合數(shù)字微流控芯片的雙熒光LAMP反應(yīng)體系。4)觀察數(shù)字LAMP微流控芯片自吸式進樣流程。5)用已知單重感染HPV6、16、18、39、52、58、59的臨床標(biāo)本驗證數(shù)字LAMP的特異性。6)用數(shù)字LAMP微流控芯片對濃度為6×10~-44 pg/μL的HPV16質(zhì)粒DNA進行精確定量。結(jié)果:1.340μM HNB與1:10000 SYBR Green I混合構(gòu)建的雙熒光指示劑在IMSA反應(yīng)體系中具有明確的指示效果,455 nm藍光激發(fā)下發(fā)生擴增的反應(yīng)管雙熒光顯色為黃綠色,未發(fā)生擴增的反應(yīng)管為橘紅色;該方法對HPV16、52型檢測限分別達到了60拷貝/反應(yīng)和600拷貝/反應(yīng);可特異性檢出樣品中HPV16和HPV52;與臨床檢測結(jié)果比對無差異。2.在PCR管中雙熒光LAMP對HPV16型的檢測限為4×10~-44 pg/μL,并可特異性檢出HPV16;制作的微流控芯片可實現(xiàn)自吸分液式進樣,并可實現(xiàn)對HPV16型數(shù)字LAMP檢測,150μM HNB與1:10000 SYBR Green I混合構(gòu)建的雙熒光指示劑在數(shù)字LAMP微流控芯片的微反應(yīng)小室內(nèi)具有明確的指示效果,455 nm藍光激發(fā)下發(fā)生擴增的微反應(yīng)小室雙熒光顯色為黃綠色,未發(fā)生擴增的微反應(yīng)小室為橘紅色;數(shù)字LAMP微流控芯片可實現(xiàn)HPV16型的精確定量,對濃度為6×10~-44 pg/μL的HPV16質(zhì)粒DNA進行精確定量其濃度為163 copies/μL,并可特異性檢出HPV16型。結(jié)論:1.本研究建立的HPV16、52型等溫多自配引發(fā)擴增檢測方法可用于HPV分型快速篩查,實現(xiàn)更簡易明確的結(jié)果判讀,適合基層醫(yī)療機構(gòu)開展HPV基因篩查。2.本研究成功構(gòu)建了可用于數(shù)字LAMP檢測的微流控芯片,芯片滿足數(shù)字化檢測的各項需求,并且無需外接動力系統(tǒng)和微閥門,該芯片能夠?qū)崿F(xiàn)高危HPV16型的快速精確定量檢測,并且特異性良好。
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R440
【圖文】：

（A）120 μM HNB; (B)340 μM HNB; (C)420 μM HNB; 陽性反應(yīng)：IMSA 對 1.2×104拷貝HPV52 質(zhì)粒 DNA 分子擴增；陰性反應(yīng)：IMSA 對去核酸酶無菌水(代替 DNA 模板)擴增圖 2-1 不同濃度 HNB 與 1：10000 SYBR GreenⅠ組成的雙熒光 IMSA 指示系統(tǒng)熒光光譜和雙熒光顯色圖

圖 1-1 HPV16 質(zhì)粒目的基因序列Figure .1-1 The plasmids with target gene sequence of HPV161.2 常用試劑與耗材SU8-2025，SU8-2075 購自美國 Micro Chem 公司；單晶硅片購自浙江開化縣

微流控芯片的通道層設(shè)計

【參考文獻】

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本文編號：2774849