【摘要】：目的建立ABCG2基因13個(gè)單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)位點(diǎn)(rs3114018、r3114020、rs2231146、rs2231164、rs2725252、rs55976258、rs12641369、rs34455506、rs1448784、rs10011796、rs2725244、rs34472643、rs3114015)檢測的分子診斷技術(shù),并驗(yàn)證ABCG2基因多態(tài)性在中國蘭州地區(qū)原發(fā)性痛風(fēng)人群中的遺傳易感性。方法應(yīng)用Primer-BLAST軟件設(shè)計(jì)ABCG2基因13個(gè)SNP位點(diǎn)的特異引物,建立臨床常規(guī)化的PCR-HRM分子診斷檢測體系。以Sanger測序法為金標(biāo)準(zhǔn)對所建方法學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證,評價(jià)其靈敏度、特異性、重復(fù)性和再現(xiàn)性。通過檢測398例原發(fā)性痛風(fēng)患者臨床標(biāo)本評價(jià)其臨床適用性。以千人基因組數(shù)據(jù)庫中的中國人群基因型數(shù)據(jù)為對照進(jìn)行病例對照分析,驗(yàn)證其在中國蘭州地區(qū)原發(fā)性痛風(fēng)人群中的易感性。采用卡方檢驗(yàn)和二項(xiàng)Logistic回歸分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,評價(jià)ABCG2基因多態(tài)性的痛風(fēng)易感性,采用連鎖不平衡(Linkage Disequilibrium,LD)和單體型分析評價(jià)單體型的痛風(fēng)易感性。結(jié)果(1)經(jīng)測序驗(yàn)證,自建的PCR-HRM檢測體系能對ABCG2基因的13個(gè)SNP位點(diǎn)準(zhǔn)確分型,并成功基因分型398份病例組標(biāo)本。性能評價(jià)結(jié)果顯示所建方法在本次13個(gè)SNP基因型檢測中的靈敏度和特異性均達(dá)100%。所有SNP位點(diǎn)的兩種純合型相應(yīng)的熔解曲線T_m值的變異系數(shù)(CV)均小于1%,且兩種基因型的T_m值差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),具有較好的重復(fù)性和再現(xiàn)性。(2)對除rs1448784位點(diǎn)外達(dá)到Hardy-Weinberg遺傳平衡的12個(gè)SNP進(jìn)行病例對照分析,發(fā)現(xiàn)有11個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率分布存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),分別是rs2231164、rs34455506、rs34472643、rs2231146、rs12641369、rs2725252、rs3114018、rs2725244、rs3114020、rs10011796和rs55976258。(3)對病例組按甘油三酯(Triglyceride,TG)分層分析,發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)患者11個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在高TG組和正常TG組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(4)在四種遺傳模型下進(jìn)行發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)回歸分析,發(fā)現(xiàn)在顯性模型和隱性模型下12個(gè)SNP位點(diǎn)的野生型均可增加痛風(fēng)的患病風(fēng)險(xiǎn),純合突變型均可降低痛風(fēng)患病風(fēng)險(xiǎn);在加性模型下,除rs34455506和rs34472643外,其他SNP位點(diǎn)的野生型均可增加痛風(fēng)患病風(fēng)險(xiǎn);在共顯性模型下以野生型為參照,rs2231164的AA、rs34455506的CT、rs34472643的AG、rs2231146的AG/GG、rs12641369的AG/AA、rs2725252的GT/TT、rs3114018的AC/AA、rs2725244的AG/AA、rs3114020的CT/TT、rs10011796的CT/CC以及rs55976258的CT/TT基因型均可降低痛風(fēng)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。(5)LD分析結(jié)果表明ABCG2基因的rs34455506和rs34472643、rs2725244和rs3114020之間D'和r~2值均"g0.8,存在強(qiáng)LD關(guān)系。(6)由11個(gè)SNP(rs2231164、rs34455506、rs34472643、rs2231146、rs12641369、rs2725252、rs3114018、rs2725244、rs3114020、rs10011796和rs55976258)構(gòu)建的單體型“ACGAAGAATCC”和“ATAGAGAATCT”可增加痛風(fēng)患病風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)論本研究建立的ABCG2基因13個(gè)SNP位點(diǎn)的PCR-HRM分子診斷方法靈敏度高、特異性好,具有較好的重復(fù)性和再現(xiàn)性,可用于臨床常規(guī)化基因分型。ABCG2基因多態(tài)性與中國蘭州地區(qū)原發(fā)性痛風(fēng)的易感性相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R589.7;R440
【圖文】：

誆慰賈搗段紕凇１?3.1 痛風(fēng)患者臨床資料的統(tǒng)計(jì)描述3.2 提取基因組 DNA 質(zhì)量的鑒定用 1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳對提取的基因組 DNA 進(jìn)行完整性驗(yàn)證。如圖3.1 所示，電泳結(jié)果表現(xiàn)為一條背景清晰的單一明亮條帶，證明基因組 DNA 的完整性較好。圖中“M”指 100-600 bp 的 DNAmarker，從上到下依次為 600、500、400、300、200、100 bp。對所有核酸標(biāo)本進(jìn)行濃度和純度檢測，結(jié)果 DNA 濃度項(xiàng)目（單位） ±SD 參考值范圍性別男（例）女（例）38018——年齡（歲） 43.60±14.10 —FBG (mmol /L) 5.36±1.21 3.60-6.10SUA (μmol /L) 485.69±121.25 0.00-420.00TC (mmol /L) 7.96±4.42 2.30-5.80TG (mmol /L) 2.29±1.59 0.45-1.80LDL-C (mmol /L) 2.72±0.84 1.20-3.30HDL-C (mmol /L) 1.05±0.342 0.70-2.20BUN (mmol /L) 5.34±2.10 1.80-8.00Scr (μmol /L) 88.77±28.49 12.00-133.20白細(xì)胞計(jì)數(shù)( ×109/L) 7.32±2.30 4.00-10.00

圖 3.2 13 個(gè) SNP 位點(diǎn) PCR 產(chǎn)物特異性驗(yàn)證結(jié)果3.3.2 PCR-HRM 檢測體系的建立在優(yōu)化后的 PCR-HRM 檢測體系下，ABCG2 基因的 13 個(gè) SNP 位點(diǎn)均能準(zhǔn)確進(jìn)行基因分型，如圖 3.3 所示。對于 rs34472643 G>A 和 rs3114015 G>C，根據(jù)

3個(gè)SNP位點(diǎn)PCR-HRM分型圖

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本文編號(hào)：2774368