【摘要】：目的探討不同微泡(microbubble,MB)劑量、機械指數(shù)(mechanical index,MI)和超聲輻照時間對診斷超聲聯(lián)合MBs開放小鼠血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)的影響,優(yōu)化參數(shù)增加BBB通透性,減少腦組織損傷,同時觀察參數(shù)優(yōu)化后BBB通透性的變化規(guī)律,并對其可能的機制進行初步探索。方法1.采用薄膜水化法和機械振蕩法制備脂質(zhì)MBs,顯微鏡觀察形態(tài)并計數(shù)濃度,粒度分析儀測量粒徑及分布,評價MBs穩(wěn)定性,并觀察其在小鼠心腔內(nèi)增強顯影效果。2.采用診斷超聲系統(tǒng)在flash模式下,以不同的MB劑量、MI和超聲輻照時間輻照小鼠紋狀體區(qū),伊文氏藍(Evans Blue,EB)染色定性與定量評價BBB開放情況,HE染色評價腦組織損傷情況,篩選出最優(yōu)實驗參數(shù)。Western blotting和組織免疫熒光染色檢測BBB開放前后緊密連接(tight junction,TJ)相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表達情況,透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)觀察TJs超微結(jié)構(gòu)的改變。3.EB染色定性與定量評價參數(shù)優(yōu)化后BBB通透性變化規(guī)律,western blotting和組織免疫熒光染色檢測BBB開放后不同時間點TJ相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5表達水平的變化。HE染色評價BBB開放對小鼠主要器官的影響。結(jié)果1.自制MBs呈中央半透亮的球形,濃度為(3.63±0.11)×10~9MBs/ml,平均粒徑為1546.8±114.2nm,制備后6小時內(nèi)粒徑和濃度相對穩(wěn)定,能夠顯著持續(xù)增強小鼠心腔顯影,半衰期為(2.97±0.54)分鐘。2.隨著MB劑量、MI和輻照時間增加,腦組織EB滲出量增加,藍染程度增加。MI小于等于0.4時,未見明顯組織學(xué)損傷;當(dāng)MB劑量增加到1.0×10~7MBs、MI增加到0.8或輻照時間增加到3分鐘時,僅見少量散在紅細胞或小片狀紅細胞滲出;MB劑量為2.0×10~7MBs或輻照時間為4分鐘時,紅細胞滲出量增加,受損血管周圍可見散在深染的缺血或凋亡神經(jīng)細胞,神經(jīng)纖維網(wǎng)輕度空泡樣變性。MB劑量為3.0×10~7MBs時,可見明顯廣泛紅細胞滲出,伴隨著神經(jīng)細胞顯著減少,神經(jīng)纖維網(wǎng)急性退行性變。BBB開放后三種TJ相關(guān)蛋白表達水平均明顯下降,同時TEM觀察到TJs開放。3.超聲輻照后0小時腦皮質(zhì)及紋狀體區(qū)BBB通透性最高,分別于6小時和4小時后恢復(fù)正常。三種TJ相關(guān)蛋白超聲輻照后0小時表達水平迅速下降,6小時后恢復(fù)正常水平。除BBB開放6小時組小鼠腦組織有少量紅細胞滲出外,其余時間點各器官均未見明顯組織學(xué)損傷。結(jié)論1.成功制備了脂質(zhì)MBs,具有濃度較高,粒徑均一,穩(wěn)定性較好,半衰期長,能夠明顯增強體內(nèi)顯影效果等特點。2.隨著MB劑量、MI與超聲輻照時間的增加,BBB開放程度增大,腦組織損傷的風(fēng)險也隨之增加。3.在GE Vivid E9超聲診斷系統(tǒng)的實時引導(dǎo)下,超聲頻率為1.5/3.0MHz,MB劑量為1.0×10~7MBs,超聲強度MI為0.8,超聲輻照時間為3分鐘,可以實現(xiàn)經(jīng)顱、無創(chuàng)、可逆的開放較大范圍的小鼠BBB。4.在上述實驗參數(shù)下,腦皮質(zhì)及紋狀體區(qū)BBB開放持續(xù)時間分別為6小時和4小時。5.診斷超聲聯(lián)合MBs開放BBB后通透性的變化趨勢與三種TJ相關(guān)蛋白表達水平的變化趨勢基本一致。TJ相關(guān)蛋白ZO-1、occludin與claudin-5表達水平下降,引起TJs開放可能是診斷超聲聯(lián)合MBs開放BBB的作用機制之一。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R445.1;R741
【圖文】：

圖1：診斷超聲聯(lián)合靜脈注射微泡開放血腦屏障的示意圖Figure 1: Schematic representationof BBB disruption induced bydiagnostic ultrasound incombination with intravenous MB injections注：IV，intravenous。

學(xué)方法的處理與統(tǒng)計學(xué)分析采用 GraphPad Prism 5.01 軟件包，計量資料以ean± SEM）表示。兩組間比較采用 t 檢驗，多組間比較采用單因素ayANOVA）。檢驗水準(zhǔn) α=0.05，P＜0.05 表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。果眼及鏡下觀察觀察，本實驗制備的脂質(zhì) MBs 在機械振蕩前組成為均一、透明的磷 C3F8氣體；機械振蕩后，形成乳白色 MBs 混懸液（圖 1-1A，B）。稀釋后，在熒光顯微鏡下觀察，由 DiI 標(biāo)記的熒光 MBs 呈球形，形，分散性好，磷脂殼被 DiI 標(biāo)記呈紅色熒光，中央氣體核呈半透亮下形態(tài)一致（圖 1-1C，D）。

圖1-2：MBs 粒徑分布圖Figure 1-2：Size distributionofMBs性Bs 制備后不同的時間點的粒徑和濃度變化評價 MBs 的穩(wěn)定 MBs 制備后 6 小時內(nèi)，粒徑和濃度相對穩(wěn)定，制備 12 小 127.53%（P＜0.05），濃度變?yōu)槌跏紳舛鹊?81.50%（P＜果，后續(xù)動物實驗均在 MBs 制備后 6 小時以內(nèi)完成。

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本文編號：2771789